Медицинска биохимия І част

инфо

Резюме на дисциплината

Биохимия
Дисциплина
КАТЕДРА ПО ХИМИЯ И БИОХИМИЯ, 1. Медицински факултет
Активна за дистанционно обучение: да

Web-базиран проблемно-ориентиран курс

Драги колеги, редовни или задочни студенти,

Добре дошли на този първи за България Web-базиран проблемно-ориентиран интерактивен курс по биохимия. Биохимията, науката за молекулните основи на живота, е труден и обемист предмет, но в нея има логика и красота, които привличат. Тя би могла да стане по-лесна, ако я обичате. Времето, посветено на интересно занимание, лети неусетно.

Този курс, означаван и като електронен учебник, е за тези от вас, които желаят да се възползват от възможностите на Web-базираното обучение и които биха искали да учат със свое темпо, в избрано от тях време и място. В него ще намерите неща, които няма в традиционните учебници, и които ще улеснят вашата подготовка за колоквиуми, изпити или за следдипломна квалификация. Курсът ще продължи да се развива.
Засега курсът е сложно Web-място с хиляди динамично-генериращи се страници, разпределени в 3 главни части.
1) лекции като източник на основна информация и новости;
2) интерактивни тестове, които ще улеснят теоретичната ви подготовка за колоквиумите и изпита. Под форма на игра, тестовете позволяват бърза и обективна (само)оценка.
3) интерактивни симулации на клинични случаи, които улесняват създаването, подобряването и (само)оценяването на професионални умения. При решаването на всеки клиничен случай се използва досегашно и се придобива ново познание. Вместо пасивни наблюдатели, вие сами ще вземате решения и ще действате като активни участници.

Чрез този курс се обединяват предимствата на проблемното (над традиционното обучение) с предимствата, произтичащи от връзката с Интернет и световната информационна мрежа (WWW).
Курсът е предназначен за медици, стоматолози и фармацевти (редовни и задочни) в Медицински Университет, но може да бъде полезен и на други студенти и специализанти по биохимия. Необходимо е да сте преминали успешно неорганична и особено органична химия.

Други полезни раздели са "Помощни раздели" (разписания, програми, конспекти и пр.), а също и "Речник", който постепенно ще се допълва. В сайта може да се търси по един или повече биохимични термини (виж "Инструкции" в "Помощни материали". Комуникациите се осъществяват чрез вградената електронна поща, форум, новини, Връзка с нас.

Част от учебните материали са с ограничен достъп. Ако сте редовен студент, или сте одобрен за дистанционно обучение, или сте служител в МУ, ще имате достъп до повече материали, ако влезнете в Интранета, използвайки вашите потребителско име и парола. Нерегистрираните студенти (гости) имат достъп до помощни и демонстрационни материали (съдържание на курса, съдържание на лекционни раздели, примерни тестове и симулации на клинични случаи. Регистрираните студенти имат достъп до всички учебни материали наравно с редовните.

Курсът "Интерактивна биохимия" се състои от следните части:
1. Въведение в интерактивната биохимия (включва разделите Въведение, Белтъци, Нуклеинови киселини, Ензими, Биоенергетика). Тези раздели са част от библиотеката на Българския виртуален университет и са достъпни за потребители;

2. Клетката - основна единица на живота
3. Метаболизъм на въглехидрати, липиди, аминокиселини, нуклеотиди;
4. Обмяна на информационните молекули;
5. Функционална биохимия.

Тези части (2-5) от биохимията са достъпни за редовните и дистанциони студенти в МУ-София.

Запитвания, коментари, препоръки и поправки се приемат с благодарност от Г. Косекова
(e-mail: gkossekova@abv.bg), главен автор на курса.

Към катедрата по химия и биохимия

Анотация

Биохимията е наука за молекулните основи на живота.

При създаване на Web-базирания курс "Интерактивна биохимия" са поставени следните цели:

1) да се дадат познания върху състава, строежа и функциите на клетъчните компоненти, върху химичните реакции и процеси, протичащи в клетките и тяхната регулация и да се обясни тяхното значение за организма в норма и патология, давайки във всеки раздел примери за конкретно приложение на теорията в клиничната практика.

2) да се осигури възможност за самоценка на знанията чрез интерактивни тестове.

3) да се премине от пасивно към активно проблемно ориентирано обучение (редовно и дистанционно) - т.е. теорията да се учи не самоцелно, а да се прилага за решаване на интерактивни Web-базирани компютърно-симулирани казуси.

В редовното обучение всяка лекция се съпровожда с компютърни презентации - илюстрации в PowerPoint, анимации (молекулна графика) и други интерактивни програми. Същите могат да се ползват и дистанционно, което е особено подходящо за задочници и специализанти.

Учебните материали се състоят от лекции, интерактивни тестове и симулации на клинични случаи. Помощните материали включват учебни план-програми, конспекти, кратки календарни програми и др.
Ако свалите следващите два файла като щракнете върху тях с десен бутон и изберете Save target as, ще може да ги разгледате и да добиете представа за:
илюстрациите в лекциите и за някои динамично генерирани страници в
тестовете и симулациите на клинични случаи

Катедрени разписания

Лекции по биохимия - зимен сем. 2006/2007 г.



Специалност

Лектор

Ден

Час

Зала в сградата на ул. Здраве 2

Медици Проф. Ваньо Митев

вторник

сряда

9,30-11,15

11,30-13,15

ауд. 3

ауд. 3

Медици на английски език

Доц. Ганка Косекова

понеделник 11,30-13,15
14,00-15,45
стая 307
Стоматолози Доц. Върбан Ганев вторник 14,00-15,45 ауд. 1
Фармацевти

Доц. Ганка Косекова

четвъртък 8,30-11,15 ауд. 3


Разписания за упражненията по биохимия

Разписания за упражненията по биохимия


Зимен сем. 2006-2007 г.

Преподаватели

ПРЕПОДАВАТЕЛ Е-мейл    
Проф. Ваньо Митев, дбн
   
Доц. Ганка Косекова, дпн
   
Ас. Биляна Георгиева,
   
Гл. ас. Алексей Алексеев, доктор
   
Гл. ас. Анна Манева, доктор
   
Ст. ас. Петя Иванова,
   
Гл. ас. Светослав Кръстев,
   
Ас. Силвия Календерова,
   
Гл. ас. Елевтерия Димитрова, доктор
   

Помощни материали

тук да влезе и Терминологичен речник като подменю ? НЕ

Симулации на клинични случаи

Медицински Университет-София, Катедра химия и биохимия

Интерактивна биохимия-София

Добре дошли в

Симулации на клинични случаи

Main Page
Other Simulations
Web-designers:
L. Markova
М. Dulgerova

Medical University - Sofia

Department of Chemistry and Biochemistry

Last change - April 2007

G. Kossekova

Simulation of a clinical case

"Emil"


Translation into English - Ivan Valeriev Ivanov, 2nd year student in Medicine, 2006/2007
To run the programs you need Internet Explorer 6.0.
To read Cyrillic you need Encoding Cyrillic Windows-1251 with Cyrillic font
Instructions to run the simulations
History of disease Solving the case
Acknowledgements:
The simulation of this clinical case has been created with the support of the Medical University - Sofia
(grant 7/2000-2002 and 12/2006).
The simulation is free for educational use on-line.
To prepare new versions of the simulation or other simulations, permission is needed.

Questions, comments or suggestions are wellcome and would be gratefully acknowledged by G. Kossekova and collaborators.

(E-mail: gkossekova@abv.bg)

Симулации на клинични случаи

Медицински Университет-София, Катедра химия и биохимия

Интерактивна биохимия-София

Добре дошли в

Симулации на клинични случаи

Инструкции за проиграване на симулациите

Клиничните случаи са дадени по-долу по имената на пациентите. Заболяванията са дадени в отделен списък.

Изберете случай за решаване:


Румен Чарли Павлин Том
Васил Марина Никола Тодор
Васил ІІ Кирил Зорница Георги
Димитър Сандра Павел Дарена
Росица Емил Милена Славка

 

Заболявания
Интерактивните симулации са посветени на следните клинични случаи: Сърповидно-клетъчна анемия; Таласемия; Инфаркт на миокарда; Пируват-дехидрогеназна недостатъчност; Глюкозо-6-фосфат дехидрогеназна недостатъчност; Галактоземия; Гликогеноза; Захарен диабет (инсулин-зависим и инсулин-независим тип); Хипогликемия; Кетоацидоза; Фамилна холестеролемия; Фенилкетонурия, Вирусен хепатит; Болест на Паркинсон; Подагра; Хемолитична жълтеница; Порфирурия; Ксеродерма пигментозум.

Авторите са дадени във всяка симулация.

Успех при решаване на случаите!


Благодарности:
Изказва се благодарност на проф. Марсел Бланшер, Университет в Манитоба, Канада
като поканен автор на сценария на клиничния случай "Чарли". .

Разрешения: Симулациите са свободни за образователни цели on-line.

Програмите за създаване на симулации не могат да се използват без разрешение от Медицински Университет-София.
За контакти: Г. Косекова , e-mail: kossekov@medfac.acad.bg

Лекции

info

Въведение

Цели

Целите на преподаване и учене са запознаване с предмета, целите, обхвата и значението на биохимията за медицината през 20 и 21 век.

1. Резюме

Биохимията изучава молекулните основи на живота в разнообразните му проявления от вируси до човек.

Биохимията и медицината са неразривно свързани. Здравето зависи от хармоничното равновесие на протичащите в тялото биохимични реакции, а болестта отразява отклонения или нарушения в биомолекулите, биохимичните реакции или процеси.

Прогресът в биохимичната теория осветлява много области в медицината, и обратно, изучаването на болестите, допринася за обогатяването и доразвиването на биохимията. Биохимичният подход в медицината е основен за разкриване причините за заболяванията и назначаване на терапия.

Биохимичните лабораторни изследвания са необходими за поставяне на диагноза и проследяване хода на заболяването.

Доброто познаване на биохимията е необходимо за всички, работещи в системата на здравеопазването.

2. Предмет, цели и обхват на биохимията

Биохимията е наука за химичните основи на живота.

Теоретичните цели на биохимията са да изучи на молекулно равнище състава, структурата и функциите на клетъчните компоненти, химичните реакции и процеси, протичащи в клетките и тяхната регулация, както и да обясни значението им за организма в норма и патология.

Практическите цели на биохимията са:
а) да се обосноват рационалните основи на храненето за различни стадии на растеж и диференцировка;
б) да се диагностицират болестите и да се следи протичането им по изменение химичния състав на кръв, урина и други биологични течности;
в) да се създаде научна основа на химиотерапията, като се обезпечи избирателно разрушаване на клетките на болестните причинители, неутрализиране на токсини и заместване на липсващи компоненти.

Съвременната биохимия е основа за разбиране на метаболизма в норма и патология и нейното познаване осигурява:
1) разбиране и поддържане на здравето чрез подходящ хранителен и двигателен режим;
2) разбиране и ефективно лечение на болестите.

Обхватът на биохимията е толкова широк, колкото самият живот. Биохимията изучава химичните процеси в микроорганизми, растения, насекоми, риби, птици, бозайници и човек. Студентите в Медицински Университет изучават предимно биохимия на човека, но разбирането на биохимията на по-прости организми има директно отражение върху биохимията на човека. Например съвременните теории за регулация на гените и ензимите в човека произлизат от пионерни изследвания предимно върху бактерии. Рекомбинантните ДНК технологии се оформиха благодарение на изследвания в бактерии и вируси. Изучаването на вирусни онкогени позволи да се хвърли светлина върху превръщането на човешките клетки в ракови.

3. Роля на биохимията за развитие на медицината

Знанията по биохимия са съществени за всички биологични и медицински дисциплини. Генетиката се основава на биохимията на нуклеиновите киселини. За изучаване на фармакология и фармация са нужни солидни познания по биохимия. Лекарствата влизат в сложни взаимодействия с биохимичните процеси. Съвременната фармацевтична промишленост ползва много от достиженията на биохимията по отношение на антиметаболитите. Същото важи и за токсикологията - отровите действат върху биохимични реакции и процеси. Изучаването на основни проблеми на патологията като възпаление, клетъчно увреждане, рак, е невъзможно без прилагане на съвременни биохимични подходи. Няма медицинска дисциплина, която да не ползува достиженията на съвременната биохимия.

Има много примери за успешно използване достиженията на теоретичната биохимия в разработка на практически медицински въпроси и обратно, забележителни биохимични открития са направени въз основа на обобщаване резултатите от приложни медицински изследвания. Например познаването на белтъчната структура и функция бе необходимо, за да се осветли единствената биохимична разлика между нормален хемоглобин (Нb А) и патологичния НbS, причиняващ сърповидно-клетъчната анемия. Обратно, анализът на НbS допринесе съществено за развитието на нашите познания за нормалния НbА и други белтъци. Други примери за реципрочна полза за биохимията и медицината касаят: познания върху обмяна на въглехидрати и захарен диабет, обмяна на липиди и атеросклероза, обмяна на нуклеинови киселини и генетични (наследствени) или молекулни болести. Усилията да се разбере причината за наследствената болест фамилна хиперхолестеролемия (протичаща с тежка атеросклероза още в ранна възраст) доведоха до значителен напредък върху знанията ни за клетъчни рецептори и механизмите на поемане на холестерол от клетките. Изследванията върху онкогени в ракови клетки допринесоха за изясняване молекулните механизми за контрол на растежа в нормални клетки.

Знанията по биохимия са полезни не само на професионалистите, но и за всеки обикновен човек. Все по-голямо внимание се отдава на превантивната медицина - например чрез оптимално хранене да се осигури правилен растеж, предпазване от атеросклероза, предпазване от рак, предпазване от остеопороза и пр.

4. Биохимичните изследвания са решаващи за диагнозата, прогнозата и лечението

Както няма медицинска дисциплина, неповлияна от успехите на биохимията, така и няма клиника без биохимична лаборатория. Ето примери за приложение на биохимичните изследвания в медицината:

1. Разкриване причините и механизма на заболяването - напр. наследствена галактоземия ( фиг. 0-1). На тази фигура е дадена опростена схема за разграждането на галактоза. При недостатъчност на един от ензимите (Е2), необходими за това разграждане, в новородени се получава ензимен блок (представен с дебела черна хоризонтална линия). Натрупват се галактозо-1-фосфат и галактоза, които над определено ниво са токсични за мозъка и други органи и детето може да умре.


Фиг. 0-1. Познанията върху обмяна на галактоза позволяват да се разкрият причините и механизма на заболяването галактоземия.

2. Предлагане на рационално лечение въз основа на разкритите причини и биохимичен механизъм - напр. при галактоземия от храната трябва да се изключи млечната захар лактоза (дизахарид, изграден от глюкоза и галактоза). Това става чрез спиране на кърменето и преминаване към изкуствено хранене без лактоза и галактоза.

3. Поставяне на диагнозата - напр. за доказване на инфаркт на сърцето. Той настъпва при увреждане на част от сърдечния мускул поради влошено кръвоснабдяване. За поставяне на диагнозата се изследва дали в серума е увеличена активността на определени типични вътреклетъчни ензими, които се отделят от разрушените сърдечни клетки, напр. креатин киназа, трансаминази или други ензими.

4. Проследяване на заболяването в динамика (подобряване, влошаване) - напр. при сърдечен инфаркт полезна информация за състоянието дават промените в серумните активности на ензимите креатинфосфокиназа, глутамат оксалацетат трансфераза и лактат дехидрогеназа (фиг. 0-2). При хепатит и други заболявания също се следят промени в ензимни активности.


Фиг. 0-2. Промени в активностите на серумни ензими след инфаркт на миокарда

1 - креатин киназа, 2 - глутамат оксалацетат трансаминаза, 3 - лактат дехидрогеназа.

5. Скриниращи тестове за ранна диагностика на някои заболявания
Например доказването на аминокиселината фенилаланин и нейни продукти в урината служи за откриване на фенилкетонурия при новородени. Тестът се прави за всички новородени бебета в много страни по света, вкл. и у нас.

6. Оценяване на отговора на болестта спрямо терапията - напр. при захарен диабет инжектирането на инсулин снижава кръвната глюкоза и нормализира до голяма степен въглехидратната, мастната и белтъчната и др. обмени, намаляват болестните изменения.

5. Главни постижения на биохимията през 20 век и очаквани постижения през 21 век

Много са важните постижения в областта на биохимията, полезни за медицината, с които биохимиците могат да се гордеят.
Изучен е химичният състав на клетките и тъканите в човешкия организъм.
Установена е структурата на главните съединения, които се срещат в него и са изяснени техните функции.
Особено важно е изясняването на функциите на нуклеинови киселини и белтъци - ролята на ДНК за съхраняване и предаване на наследствената информация на информационна РНК, която детерминира аминокиселинната последователност в белтъци. Първоначално формулираната "централна догма: ДНК --> РНК --> белтък" (закон на Франсис Крик) бе допълнена и разширена с възможността за обратна транскрипция, напр. във вируса, предизвикващ синдром на придобита имунна недостатъчност (СПИН).
Развитието на рекомбинантната ДНК технология оказа изключително голямо влияние във всички медико-биологични науки, и особено в медицината.
Изучени са и класифицирани голям брой биокатализатори: с белтъчна природа (ензими). Открити са биокатализатори, спадащи към РНК (рибозими).
Установени са метаболитните пътища за разграждане и синтеза на нискомолекулни и високомолекулни биологично важни съединения.
Изучени са структурите на субклетъчните органели и са изяснени техните функции.
Изяснен е механизмът на биологичното окисление и окислително фосфорилиране.
Изяснени са важни механизми на регулация на молекулно, клетъчно и организмово ниво.
Изучена е ролята и функциите на разнообразни биологични мембрани.
Изяснени са биохимичните основи и механизъм за развитие на голям брой заболявания.
През 21 век главното засега и с изключителна важност постижение е предсрочното завършване на проекта за човешкия геном, който към 15.04.03 е изучен 99,99%. Идентифицирането на гените върху всички хромозоми предлага на учените по цял свят неоценими възможности да подобряват здравето на хората и да побеждават болестите. Знанието за гените ще позволи да разбираме как те повлияват развитието на болестите, ще помогне на изследователите да асоциират дадени гени с определени болести и ще улесни създаването на нови лекарства.
Главни проблеми за решаване остават изясняване биохимичните основи на развитието, клетъчната диференциация и мозъчните функции. Това предполага по-детайлно изучаване на механизмите на генната регулация, т.е. защо и как еукариотните гени се включват и изключват по време на развитието и диференциацията, а също и как нормални клетки се превръщат в ракови.
Очаква се задълбочаване на познанията в областта на клетъчното деление и растеж, съзнание и памет, механизми на клетъчна секреция и др.

Клетката - основна единица на живота

1. Цели

Автор Проф. Тодор Николов

Цели на преподавателя:

В тази преговорна глава се прави кратък преглед на изученото в химията и биологията. Затова целите са да се акцентира на значението, видовете, състава и структурната организация на клетките, да се въведе представата за протичащите в тях метаболитни процеси и да се разгледат примери за значението на тези знания за клиниката.

След работа с този раздел студентите ще могат да демонстрират:
А. Знания
1. Да дадат определение и примери за едноклетъчни и многоклетъчни организми и за прокариотни и еукариотни клетки;
2. Да изброят физикохимическите свойства на водата, които я правят "подходяща" вътрешна среда на организмите;
3. Да дефинират какво представлява водородният експонент (рН) и константата на дисоциация на слаби киселини (рКa) съгласно уравнението на Henderson-Hasselbalch;
4. Да дадат определение и примери за буфери с биологично значение;
5. Да изброят макроминералите и микроминералите в организма и посочат значението им;
6. Да дадат определение за органични съединения, основни и производни структури;
7. Да дадат определение за стереоизомери и илюстрират с примери изомерията при монозахариди; да дадат примери за монозахариди с пиранозни и фуранозни пръстени;
8. Да дадат примери за други основни органични структури като алифатни алкохоли, алдехиди, кетони и амини, изопренови производни, ароматни съединения, хетероциклени съединения;
9. Да дадат определение за комплексни органични съединения и биологични макромолекули;
10. Да дадат определение за биологична обмяна и междинна обмяна, за обменни пътища, обменни стъпала и обменни цикли;
11. Да дадат определение за автотрофни и хетеротрофни организми и за анаеробни и аеробни организми;

Б. Разбирания
1. Да обяснят как дисоциират водните молекули и изведат дисоциационната константа и йонното произведение на водата;
2. Да класифицират карбоксиловите киселини;
3. Да класифицират монозахаридите;
4. Да илюстрират с примери и обяснят разликата между алдози и кетози, между a и b-аномери и между епимери;
5. Да обяснят механизмите за получаване на производни органични структури: полимеризация и кондензация;
6. Да обяснят структурата и функциите на клетъчните мембрани и видовете транспорт през тях:
7. Да обяснят структурата и функциите на субклетъчните органели: ядро, митохондрии, ендоплазмен ретикулум, рибозоми, комплекс на Голджи, лизозоми и пероксизоми, а също и на немебранните цитоплазмени компоненти;
8. Да преценят преимуществата на цикличните процеси;
9. Да обяснят кои фактори и как повлияват регулирането на обменните процеси във времето и пространството;

В. Умения
1. Да представят с формули представители на наситените и ненаситените мастни монокарбоксилови киселини с четен и нечетен брой и техни производни с допълнителни функционални групи: хидроксилна, оксо, алдехидна, карбоксилова; производни на монозахариди (онови киселини) и ароматни карбоксилови киселини;
2. Да представят с формули представители на монозахариди: триози, тетрози, пентози, хексози, хептози и техни производни: аминозахари и дезоксизахари;
3. Да представят общата формула на аминокиселините, участващи в състава на белтъците;
4. Да представят с формули представители на алифатни алкохоли, алдехиди, кетони и амини, изопренови производни, ароматни съединения, хетероциклени съединения;
5. Да илюстрират с примери образуването на киселинно-амидна, естерна, гликозидна и киселинно-анхидридна връзка,
6. Да направят характеристика на анаболитните и катаболитните процеси.

1.1. Резюме

Всички съвременни организми от бактерии до човек са изградени от клетки. Клетката е основната и най-малка структурна и функционална единица за биологична активност. Eдноклетъчните организми се състоят само от една клетка. Многоклетъчните организми представляват съобщества от много клетки. Вирусите не притежават типичната клетъчна организация. Те проявяват признаци на живот само когато проникнат в други организми.

Клетките биват два типа: прокариотни и еукариотни. Най-съществената разлика между двата типа клетки е, че прокариотните клетки не притежават морфологично обособено ядро. Между двата типа клетки съществуват и други структурни различия. Най-общо организацията на прокариотните клетки е значително по-проста от тази на еукариотните, което отразява и по-опростен метаболизъм.

Молекулите, които изграждат живата материя биват неорганични и органични. Органичните съединения преобладават, както по видове, така и по количество. Единствено изключение е неорганичното съединение вода, която безспорно представлява далеч по-голяма част от масата на живата материя. Водата притежава редица физикохимични свойства, които я правят "подходяща" за среда на организмите. Водата е много добър разтворител на голям брой неорганични и органични вещества с изключение на липидите. Водните диполи имат склонност да се свързват с неорганични йони и с полярни химични групи, образувайки около тях хидратационни обвивки. Водата участва активно в химичните процеси и е краен продукт на аеробните окислителни процеси в биосферата.

Водата дисоцира в слаба степен до H+ и OH-. Концентрацията на протоните, изразена като pН, определя киселинността на разтвора. Киселина е вещество, което може да освобождава протони, база или основа е вещество, което може да приема протони. Протонната дисоциация на киселините се характеризира с константата на дисоциация Кa, представяна обикновено като рКa (рКa= - log Ka). Тази константа отразява относителната сила (реципрочен афинитет към протона) на дадена група като слаба киселина. Съгласно уравнението на Henderson-Hasselbalch рКa на дадена група е това рН, при което са дисоциирали 50 % от групата, т.е. концентрацията на спрегнатата база е равна на тази на спрегнатата киселина.

Буферите са смеси от слаби киселини и техните спрегнати (конюгирани) бази. Те имат способността да се съпротивляват на промяната на рН при прибавяне или отстраняване на протони от водните им разтвори. Най-голям е буферният капацитет в рН интервала около рКa.

Организмите съдържат голям брой неорганични вещества - макроелементи (натрий, калий, калций и магнезий, фосфор и хлор) и микроелементи: катиони (желязо, манган, мед, кобалт, цинк, селен, хром, молибден) и аниони (йод и флуор).

Въглерод, кислород, водород и азот са главните съставки на повечето биомолекули.

Органичните съединения се делят на две основни групи - основни и производни органични структури. Основни структури притежават тези органични съединения, които не подлежат на хидролиза. Производни органични структури, т.е. молекули, са тези, които биха могли да се подложат на хидролиза. Разгледани са карбоксилни киселини, монозахариди, аминокарбоксилни киселини и други органични структури, без претенции за изчерпателност, но от гледна точка на значението им за организма, както и възможностите за свързване между тях чрез ковалентни връзки или нековалентни взаимодействия.

Петте главни биологични макромолекули са ДНК, РНК, белтъци, полизахариди и липиди. Една част от тях са хомобиополимери (изградени чрез свързването на еднотипни, в някои случаи идентични основни структури). Когато градивните единици при полимерите са еднотипни, но не идентични, се говори за хетебиорополимери.

Биополимерите със своята склонност към конюгиране и агрегиране играят централна роля при създаване на закономерна и стройна вътреклетъчна организация. Описани са накратко от гледна точка на тяхната биологична функция клетъчните органели и други субклетъчни компоненти: мембрани, ядро, митохондрии, ендоплазмен ретикулум, апарат на Голджи, лизозоми, пероксизоми. Рибозомите, цитоскелетът и цитозолът са други важни компоненти, които могат да се изолират като субклетъчни фракции. Чрез координираните функции на тези субклетъчни органели се осъществява дейността на клетките в човешкия организъм.

Организмът поема от околната среда вещества и енергия, които преобразува за свои нужди, но също така връща в нея преработени продукти и енергия. Именно това взаимодействие на организма със средата се нарича биологична обмяна. Попаднали в организма, хранителните вещества се подлагат на най-разнообразни химични превръщания, съвкупността от които се нарича междинна обмяна. Превръщането на хранителните вещества в собствени, характерни за организма биополимери и в необходими за функционирането му активни съединения обхваща част от обменните процеси, наречени анаболитни. Едновременно с анаболитните процеси в организмите се извършват непрекъснато процеси на разграждане на биополимерите и хранителните вещества до по-нискомолекулни съединения. Тези процеси обхващат втората страна от обмяната на веществата и се наричат катаболитни. Освободената при тях енергия се използва за нуждите на организма - за провеждане на ендергоничните синтези, за извършване на друг вид работа и т.н. Следователно най-общо катаболитните процеси са необходимо допълнение на анаболитните процеси. Анаболитните и катаболитните процеси, асимилационните и дисимилационните процеси са противоположни, но свързани неразривно едни с други.

Както анаболитните, така и катаболитните процеси са вериги от химични реакции - свързани една с друга, следващи една след друга. Тези вериги се наричат обменни пътища, а отделните реакции в обменните пътища - обменни стъпала. Стъпалата в обменните пътища се катализират от ензими. Друга характерна особеност на обмяната на веществата е наличието на кръгови процеси, или т. нар. обменни цикли. Цикличните процеси позволяват посредством малки количества междинни метаболити или кофактори да се преработва голямо количество вещество; те са израз на тенденцията в организмите към пестене на средства.

Обменните пътища са разположени не само във времето, но и в пространството. Сложната структура на еукариотната клетка позволява едновременното осъществяване на огромен брой реакции и функции. Клетките на многоклетъчните организми взаимодействат и помежду си, влияят си и участват в поддържане на клетъчния и тъканен баланс и така осигуряват добро състояние на целия организъм. За тази цел метаболитните пътища са строго регулирани и сложно координирани.

Според типа на обмяната организмите се делят на автотрофни и хетеротрофни. Автотрофните организми използват като източници за своите биологични синтези неорганични съединения, които получават от околната среда, т.е. те се "хранят" с неорганични вещества. Хетеротрофните организми се "хранят" с органична материя. Освен на автотрофни и хетеротрофни обменните процеси се разделят на други две големи групи - аеробни и анаеробни. Аеробен е този тип на обмяната, при който окислителните процеси се извършват за сметка на атмосферен кислород. Аеробните организми дишат - т.е. приемат непрекъснато кислород от атмосферата. Анаеробен е този тип на обмяната, при който окислителните процеси се извършват в отсъствие на кислород.

Познаване структурата, функциите и метаболизма на клетките в нормален здрав организъм е необходима предпоставка за разбиране отклоненията, които са в основата на много болести. Предложени са три примери (митохондрийни болести, апоптоза, подагра), за да се демонстрира значението на знанията върху клетъчната структура, функции и регулационни механизми за медицината.

1.2. Едноклетъчни и многоклетъчни организми

Клетката е най-малката структурна и функционална единица на живота. Тя е в основата на всички съвременни организми от бактерии до човек. Много от организмите се състоят само от една клетка. Това са едноклетъчните организми. Други представляват съобщества от много клетки. Това са многоклетъчните организми. Човешкият организъм се състои от около 100 трилиона клетки. Пространствата между клетките на многоклетъчните организми съдържат вещество, наречено междуклетъчен или интерстициален матрикс. Компонентите на интерстициалния матрикс се синтезират в клетките и излъчват от тях. Извън клетките те могат да претърпят малки биохимични промени.

Най-старите организми са били едноклетъчни и се предполага, че са били и хипертермофилни, т.е. извършвали са жизнените си функции при твърде високи температури, каквито са били температурите на земната повърхност по време на появата на живота. И понастоящем на Земята обитават едноклетъчни организми, включително и термофилни. Повечето от тях са бактерии.

На Земята обитават и организми, които не притежават типичната клетъчна организация. Това са вирусите. Те проявяват признаци на живот само при известни условия, от които най-същественото е да проникнат в други организми - както едноклетъчни, така и многоклетъчни. Предполага се, че вирусите са възникнали в по-късни пероди от развитието на живота на Земята, като изява на максимално развит паразитизъм.

1.3. Прокариотни и еукариотни клетки

По своята организация и морфология клетките биват два типа: прокариотни и еукариотни. Най-съществената разлика между двата типа клетки е, че прокариотните клетки не притежават морфологично обособено ядро. Между двата типа клетки съществуват и други структурни различия. Най-общо организацията на прокариотните клетки е значително по-проста от тази на еукариотните, което отразява и по-опростен метаболизъм. Протоплазмата на прокариотните клетки е най-общо казано недиференцирана, докато еукариотните клетки съдържат в протоплазмата си различни цитоплазмени структури, повечето от които са отделени от цитозола с мембрани. Това създава при еукариотните клетки така наречената компартментализация. И двата типа клетки са отделени от околната среда с клетъчна мембрана. Прокариотните клетки, и някои еукариотни клетки обаче, притежават и клетъчна стена, която обгражда мембраната им от вън и ги предпазва от разнообразни неблагоприятни влияния на средата и най-вече от промени в осмотичното налягане. Това се отнася предимно до едноклетъчните прокариоти и еукариоти. Развита клетъчна стена имат и растителните клетки.

Много по-голяма част от едноклетъчните организми са прокариоти. Такива са архибактериите и бактериите. Прокариотните организми са еволютивно по-стари от еукариотните. По-подробното устройство на еукариотната животинска клетка ще бъде разгледано в т. 1.5.

1.4. Химичен състав на клетката

Живата материя е изградена от огромно количество различни видове молекули. Те изграждат клетката, а при многоклетъчните организми - и интерстициалния матрикс. Всъщност живата материя представлява съвкупност от огромно количество различни видове молекули.

Молекулите, които изграждат живата материя биват неорганични и органични. Органичните съединения преобладават, както по видове, така и по количество. Единствено изключение е неорганичното съединение вода, която безспорно представлява далеч по-голяма част от масата на живата материя.

1.4.1. Вода и нейното значение

Живата материя се е зародила във водна среда (първичния океан) и затова водата е основна съставка на организмите. Някои организми, например медузите, съдържат над 99% вода. Възрастният човек съдържа около 60% вода, докато новородените - около 70%. През ранните стадии на ембрионалното развитие водното съдържание достига до 97%.

При многоклетъчните организми, вкл. човека, водата се намира в клетките, в междуклетъчните пространства и в телесните течности (кръвна плазма, лимфа). Около две трети от водата при човека се намира вътреклетъчно. Около една четвърт от останалата една трета вода се намира в кръвната плазма, а останалите три четвърти в междуклетъчните пространства и лимфата. Някои органи при човека са "по-водни", напр. бъбреци, мускули, а други съдържат по-малко вода. Сравнително бедни на вода са костната, хрущялната и мастната тъкани.

Водата притежава редица физикохимически свойства, които я правят "подходяща" вътрешна среда на организмите. Тя има висок специфичен топлинен капацитет (4,19 J.K-1.kg-1), много висока топлина на изпарение и след металите е най-добър проводник на топлината. Тези нейни свойства, съчетани с нейното голямо процентно съдържание в организма правят от водата отлично средство за неутрализиране на значителните количества топлена, отделяни в организма при екзотермични процеси. Водата поглъща отделяната топлина, като при това възможно най-малко повишава температурата си, а след това я излъчва чрез изпарение (пот) или чрез отделяните екскрети (урина). Поради добрата си топлопроводимост водата спомага за поддържане на почти еднаква температура във всички клетки на тялото и не позволява микропрегрявания.

След живака водата има най-високо повърхностно напрежение в сравнение с останалите течности - около 72 дини/cm-1 при 20oC. Повечето вещества, разтворени във водата, понижават повърхностното напрежение, поради което се "стремят" да се натрупат на граничната повърхност вода/друга фаза.

Водата има сравнително нисък вискозитет (1 mPa.s при 37oC), което я прави леко подвижна и с нисък коефициент на триене при преминаване през капилярите. Освен това тя има много висока диелектрична константа (78,54 при 25oC) - по-висока от почти всички други познати течности. Това позволява висока степен на дисоциация на разтворените в нея електролити, т. е. възможността им да действат физиологично като йони, а не като цели молекули. Това е от съществено значение за поддържане на сравнително високо осмотично налягане на телесните течности и за протичане на много други биологични процеси. Водата е много добър разтворител на по-голямата част от органичните вещества в организма (хидрофилни молекули). Изключение правят липидите (хидрофобни молекули).

Тези изключително съществени физични константи на водата са свързани със структурата на водната молекула. Молекулата на водата представлява леко "изкривен" тетраедър, в центъра на който е разположен кислородният атом. Двете му връзки с водорода са насочени към два от върховете на тетраедъра, докато несподелените електрони от двата sp3-хибридизирани орбитала заемат двата останали върха (фиг. 1-1). Най-забележително е, че ъгълът между двата водородни атома (105o) е малко по-малък от съответния ъгъл при един правилен тетраедър (109,5o). Тази "дребна" разлика "изкривява" тетраедъра и е причина за повече от особените физико-химични свойства на водата, а оттам и за биологичните и функции.


  Фиг. 1-1. Тетраедрична структура на водната молекула.

Едно от следствията е, че електронният облак около кислородния атом e концентриран в областта, противоположна на водородните атоми. Неекранираните водородни атоми образуват област с леко позитивен товар. Така водната молекула придобива диполен характер. Водните диполи в "течната" вода се отнасят помежду си приблизително така, както във твърдата вода (леда). Те се "стремят" да се свързват една с друга чрез водородни връзки (мостове) - виж фиг. 1-2.

  Фиг. 1-2. Асоциация на водни молекули в разтвор.

Разликата е, че при твърдата вода тези връзки са доста трайни, докато при течната вода времето на полу-живот е не повече от една микросекунда (непрекъснато се образуват и разпадат). Затова водата замръзва едва при 0oC. В леда един воден дипол се свързва трайно с четири други, докато в течната вода свързването е статистически с не повече е от 3,5.

Освен помежду си, водните диполи се свързват по подобен начин и с други йони или полярни (електрически натоварени молекули), респ. химични групи (-COO-, NH3+, -S- и др.). Това е причина за сравнително високия вискозитет и повърхностното напрежение на водата, за високата степен на разтворимост на йони и полярни органични молекули. То е причина и за добрата разтворимост и стабилност на такива биополимери като белтъци и нуклеинови киселини. Тяхната пространствена структура (конформация) зависи твърде много от свързването на техни йонизирани групи с водните диполи. Във водна среда техните вериги се нагъват така, че по-голяма част от йонизиращите се групи излизат на повърхността на молекулите им, докато хидрофобните участъци "се заравят" предимно във вътрешността. Това повишава разтворимостта им и допринася за стабилността на тяхната конформация. Поради високото съдържание на хидрофилни белтъци в клетките, в междуклетъчните пространства и в телесните течности, голяма част от водата е свързана чрез водородни връзки с тях. Такива водни диполи са трудно подвижни за разлика от състоянието им в свободната от електролити и заредени групи течна вода. Такава "свързана" вода се нарича хидратационна. Хидратираните биополимери (хидрофилни белтъци) са стуктурно много по-стабилни.

Водата участва активно в химичните процеси и е краен продукт на аеробните окислителни процеси в биосферата, затова човешкият организъм отделя малко повече вода, отколкото приема за 24 часа.

1.4.2. Дисоциация на водата. рН. Буфери

Водата, макар и в много ниска степен, йонизира до водородни катиони (протони) и хидроксилни аниони. В чиста вода една молекула вода от всеки 1,8.109 се намира статистически в дисоциирано състояние.


Тази макар и в много слаба степен йонизация на водата има огромно значение за живота на земята. Фактически протоните не съществуват самостоятелно, а се свързват с водородни връзки с водните диполи, образувайки "гроздове" от протонирани водни молекули като H3O+, H5O2+ и т. н.

За практически цели обаче се приема, че във водата се намират свободни протони.

Дисоциационната константа на водата се намира в основата на измерването на така наречената киселинност на водните разтвори, т.е. концентрацията на водородните катиони в нея. Дисоциационната константа на водата се определя като:


Концентрацията на водата е 55,56 mol/L  или 55,56 M и остава (поради ниската степен на дисоциация) практически постоянно. Тогава

От тук може да се изведе нова константа [H+] [OH -], която се нарича йонно произведение на водата (Kw), равно на 10 -14 (mol/L)2.

Много важен извод от това е, че йонното произведение на водата не се изменя от прибавяне на киселини или основи към нея. Прибавянето на киселини повишава концентрацията на H+, но съответно намалява концентрацията на OH -. Обратното става при прибавяне на основа. Йонното произведение на водата свързва тези две концентрации една с друга.

Поради ниските стойности на концентрацията на водородните, респ. хидроксилните йони, Сьоренсен през 1909 г. е въвел понятието водороден експонент (рН). Това е отрицателният логаритъм от концентрацията на водородните йони. В чистата вода тази концентрация, както видяхме, е 10 -7 и следователно рН на водата е 7,0. Това определя неутрална среда, в която концентрациите на водородните и хидроксилните йони са равни. Прибавяне на киселина във водата повишава концентрацията на водородните йони и респективно намалява тази на хидроксилните йони; рН става по-ниско от 7 и това определя кисела среда. Обратно, рН над 7 определя алкална среда.

В организма съществена роля играят съединения, които се третират като слаби киселини или основи. В химията понятието киселина кореспондира със състояние, при което съответната й функционална група е протонирана. Така например протонираната -COOH група е кисела и протонираната -NH2 група като -NH3+ е също кисела. Депротонираните групи - COO- и -NH2 се дефинират като конюгирани (свързани) бази на тези киселини.

Протонната дисоциация на киселините се характеризира с константата на дисоциация Кa (индексът а идва от английското название на киселина - acid), представяна обикновено като рКa (рКa= - log Ka). Тази константа отразява относителната сила (реципрочен афинитет към протона) на дадена група като слаба киселина. Съгласно уравнението на Henderson-Hasselbalch (ур. 1-1) рКa на дадена група е това рН, при което са дисоциирали 50 % от групата, т.е. концентрацията на спрегнатата база е равна на тази на спрегнатата киселина (тъй като log1=0):

Киселинността на тези групи се определя от pK - отрицателният логаритъм на тяхната дисоциационна константа. Колкото стойността на pK е по-ниска, толкова съответното съединение е по-силна киселина и обратно. Така pK на карбоксилната група е при рН между 4 - 5 и това показва, че тя е значително по-кисела от аминната група, чието pK е при рН = 9 -10.

Буферите са смеси от слаби киселини и техните конюгирани бази (или, което е равнозначно, смеси от слаби бази и техните конюгирани киселини). Те имат способността да се съпротивляват на промяната на рН при прибавяне или отстраняване на протони от водните им разтвори (т.е. прибавяне към тях на киселини или основи). Биологична роля в организма имат:
- бикарбонатният буфер (HCO3- / H2CO3),
- неорганичният ортофосфатен буфер (H2PO4-1 / HPO4-2),
- вътреклетъчните белтъци.

Интервалът на буферния капацитет е обикновено между 1 рН единица под и 1 рН единица над pKa на спрегнатата двойка. Буферният капацитет зависи и от концентрациите на спрегнатата киселина и база. Това проличава от сравнение на фосфатния и бикарбонатния буфери в кръвната плазма, където рН е 7,4. pKa на фосфатния буфер е 6,7. Би могло да се предположи, че този буфер е ефективен. Концентрацията му обаче е много по-ниска (около 20 пъти) от тази на бикарбонатния буфер, чиято рКa е 6,1. Ето защо бикарбонатният буфер допринася много повече за буферния капацитет на кръвта. Повечето органични киселини в клетъчната течност нямат голямо значение като буфери, защото техните pKa са с няколко рН единици под рН на клетката и концентрациите им са твърде ниски в сравнение с фосфатния и бикарбонатния буфери.

При биохимични експерименти се използват нефизиологични буфери, от които най-известни са TRIS (pK 8,2), HEPES (pK 7,6), MOPS (pK 2,5-4,0). Сравнително високият буферен капацитет на вътреклетъчната среда и на телесните течности поддържа в тях почти константно рН. Това има много голямо, решаващо значение за нормалното протичане на биохимичните процеси (виж глава "Ензими").

1.4.3. Други неорганични вещества освен водата

Организмите съдържат освен вода и други неорганични съединения. Най-често те се намират в разтворено състояние и при това почти напълно дисоцирани до неорганични йони. Концентрацията на водородните (респ. хидроксилните) йони обуславя рН на средата. В организмите, респ. клетките има тенденция към леко алкална реакция - рН около 7,3 - 7,4. Познати са обаче биологични среди с кисела реакция. При човека това е стомашният сок. Водородните и хидроксилни йони участват в редица биохимични реакции. Концентрацията на водородните йони има значение за активността на ензимите (виж глава "Ензими").

В организмите могат да се открият почти всички известни неорганични йони. Една част от тях е необходимо да се доставят на човека с храната в по-големи количества (над 100 mg ежедневно). Условно се наричат "макроминерали". Други са необходими в количества под 100 mg на ден, прието е да се наричат "микроминерали". Други елементи не са полезни за човека и дори някои от тях имат токсичен ефект. Те попадат в него от околната среда като замърсявания. Опасността от навлизането им в организма нараства с развитие на индустриализацията.

Към макроминералите принадлежат шест елементи: четири метала - натрий, калий, калций и магнезий и два металоиди (неметали) - фосфор и хлор. Те се намират в организма обикновено в разтворено и дисоциирано състояние като катиони или аниони. От катионите в най-големи количества са натриевите и калиевите. Общобиологична тенденция е калиевите йони да се концентрират в клетките, а натриевите - в междуклетъчните пространства. Това движение се извършва срещу концентрационен градиент с разход на енергия и с активното участие на белтъчни преносители, включени в клетъчната мембрана. Калиевите катиони са необходими за нормалното функциониране на нервните и мускулните клетки.

Натриевите катиони играят съществена роля при регулиране на плазмения обем и киселинно-алкалното равнонесие. Имат значение също така за нормалната функция на нервите и мускулите.

Калциевите йони заемат централно място при регулиране на нервната и мускулна дейност. Голяма част от калция в организма на гръбначните (човека) се намира като "утайка" в състава на костите и зъбите, заедно с магнезий и други неорганични съединения.

Магнезият заедно с калция изграждат основно костното вещество. Калциевите и особено магнезиевите йони са много съществени за действието на много ензими, най-вече като кофактори, а в някои случаи и като активатори (виж глава "Ензими").

От неметалите като макроминерали се приемат хлорът и фосфорът. Хлоридните аниони играят съществена роля заедно с натриевите при формиране на осмотичното налягане на телесните течности и при електролитния и воден баланс в организма. Обменят се с бикарбонатните йони при еритроцитите и така участват в транспорта на въглеродния диоксид. Стомашният сок съдържа голямо количество хлоридни йони.

Фосфорът се намира в по-голямата си част като фосфатни аниони, свързан с органични съединения: нуклеотиди, фосфорилирани захари, фосфолипиди и др. Свободни йони на фосфорната киселина (първични и вторични фосфати) формират една от съществените буферни системи на организма. Фосфати участват заедно с калция като важни компоненти на неорганичната съставка на костите и зъбите. За ролята на фосфатите в биоенергетиката виж в глава "Биоенергетика".

Към микроминералите в човешкия организъм могат да се посочат: желязо, манган, мед, кобалт, цинк, селен, хром, молибден (катиони) и йод и флуор (аниони).

Желязото, включено в порфиринов пръстен, е съставка на хемоглобина и на голям брой ензими. Всъщност организмът съдържа количества желязо, сравними с тези на макроминералите. Третира се като микроминерал, защото организмът го пести и хранителните изисквания за желязо са твърде малки.

Хромът е компонент на ниско-молекулен белтък, наречен хромодулин или "глюкозо-толерансен фактор", който усилва ефекта на инсулина, вероятно улеснявайки свързването на инсулин към специфичните за него рецептори. Кобалтът действа само включен в състава на витамин В12 като кофактор на някои важни ензимни реакции. Медта действа главно като кофактор на някои оксидази, от които най-съществени са цитохром c оксидазата и цитозолната супероксиддисмутаза. Влияе при резорбцията на желязото. Манганът е кофактор на пируват карбоксилаза и други ензими. Митохондрийната супероксиддисмутаза изисква манган. Молибденът е известен като кофактор на ксантин оксидазата, а селенът - на глутатион пероксидазата. Цинкът е също така кофактор на редица ензими, например карбоанхидраза, лактат дехидрогеназа и др.

Биологичната роля на йода се свързва с участието му в структурата на хормоните на щитовидната жлеза: тироксин и трийодтиронин. Флуорът има голямо значение за поддържане устойчивостта на костите и на зъбите. Доказана е ролята му при предпазване на зъбите от кариес. Сулфатни йони се намират свързани с органични молекули, най-вече хетерозахариди като естерифицират техни хидроксилни групи; явяват се и като крайни продукти при изнасяне на органично свързаната сяра от организма.

Микроминералите с изключение на желязото се съдържат в малки количества в организмите, вкл. и в човека и затова се наричат микро(олиго) елементи.

1.4.4. Органични съединения

Първоначално под понятието "органични съединения" се е подразбирало вещества, които не само се съдържат, но се и синтезират изключително в живите организми. От там произлиза и терминът “органични”. След смъртта на организмите тези съединения се подлагат на различни химични промени (предимно окислителни), докато накрая се превърнат в неорганични молекули, процес известен като минерализиране на живата материя.

Органични съединения могат да се синтезират и лабораторно. Освен това са синтезирани по лабораторен път и много органични съединения, които не са присъщи на живите организми. Затова съвременната дефиниция на органичните съединения е следната: те са съединения на въглерода. Изключения правят въглеродните оксиди и техните производни (киселини и соли), които се приемат за неорганични съединения.

Органичната химия е въвела добре мотивирана и стройна класификация на огромния брой органични съединения. Тя се основава на техните структурни особености и на наличието на различни функционални групи. Биохимията възприема напълно тази класификация. Но за по-задълбоченото вникване в биохимичните процеси е много удобно подразделянето на всички органични съединения на две основни групи - основни и производни органични структури.

1.4.5. Основни и производни органични структури - определение

Основни структури са тези органични съединения, които не подлежат на хидролиза, т.е. не притежават ковалентни връзки, които се разкъсват чрез внасяне на вода - хидролиза. Макар и по-рядко в организмите тези връзки могат да се разкъсват и чрез внасяне на фосфорна киселина, процес известен като фосфоролиза.

Основанията да се въведе такова подразделение са следните: В клетките е “забранено” да постъпват от околната среда производни органични структури, т.е. молекули, които биха могли да се подложат на хидролиза или фосфоролиза. Ако такива се намират в околната на клетките среда (например хранителната среда) , те предварително се хидролизират до съставящите ги “основни структури”, процес известен като (храно)смилане, и едва след това се усвояват (резорбират). Смилането може да се извърши извънклетъчно или вътреклетъчно, като веществата след процеса, наречен ендоцитоза, се поемат в клетката в така наречените (храно)смилателни вакуоли, на които може да се гледа (макар и включени в клетката) все още като на извънклетъчна среда. В тях производните структури се хидролизират до своите съставки. Ендогенни производни структури с по-ниски молекулни маси (олигомери) или с по-високи молекулни маси (полимери) се синтезират в биосинтетичните (анаболитни) пътища. Производните структури или изграждат биомасата на организмите, или се съхраняват като запасни хранителни вещества (хранителни резерви). Някои от тях изпълняват по-специфични биохимични задачи. При противоположните метаболитни процеси, наречени катаболитни, производните структури се разграждат до основни структури, които по-нататък се разпадат, предимно окислително, с основна цел - освобождаване на енергия, необходима за поддържане на жизнените процеси.

1.4.6. Видове основни органични структури

Основни органични структури се намират в сравнително малки количества в организмите. Причината е, че те или се разграждат много бързо в катаболитните вериги, или изграждат по-сложни производни структури. Техният полуживот в организмите по принцип е твърде кратък.

В живата материя се срещат основни структури от всички типове, познати на органичната химия. В по-големи количества и с по-голямо значение са, обаче, три типа: карбоксилни киселини, монозахариди (захари) и a-аминокиселини.

1.4.6.1. Карбоксилови киселини

Обикновено това са алифатни монокарбоксилови киселини. Те са един от двата (наред с монозахаридите) основни източници на енергия за организмите. Голямо значение имат и като съставки на сложните (комплексни) липиди: триацилглицероли, фосфолипиди, холестеролови естери и др. Мастните киселини са предимно с четен брой въглеродни атоми, и то най-вече такива с по-голям брой от 14 въглеродни атоми, наречени висши мастни киселини. От киселините с нечетен брой въглеродни атоми в природата са познати: мравчената, пропионовата, валериановата и пеларгоновата. В табл. 1-1 са представени по-съществените от биохимична гледна точка монокарбоксилови алифатни киселини.

Табл. 1-1. Някои природни наситени монокарбоксилови мастни киселини. Някои природни наситени монокарбоксилови мастни киселини.

Някои от монокарбоксиловите киселини съдържат двойни връзки - ненаситени мастни киселини. По-съществените от тях са представени на табл.1- 2. Наричат се общо “енови” киселини: моноенови с една, диенови с две, триенови с три, тетраенови с четири и т.н. двойни връзки.

Според най-често използваната номенклатура (Genevan system) въглеродните атоми се номерират от карбоксилния въглерод (въглерод № 1) към метиловата група. Въглеродните атоми № 2, № 3 и № 4 са известни и като α-, β- и γ- въглеродни атоми, съответно. Крайният въглероден атом в метиловата група е известен като ω-въглерод или n-въглероден атом. Броят на въглеродните атоми, броят и местата на двойните връзки могат да бъдат означавани по различни начини. Например за палмитолеиновата киселина (с 16 С атоми и 1 двойна връзка на девета позиция) се срещат следните означения:

Табл. 1-2. Някои природни ненаситени монокарбоксилови мастни киселини.Някои природни ненаситени монокарбоксилови мастни киселини.

В природата се срещат алифатни карбоксилови киселини, които съдържат и други функционални групи (виж фиг. 1-3). С хидроксилна група са напр. млечна, ябълчна киселина и др. Други съдържат карбонилна (оксо, респ. кето-група и алдехидна група). С оксо-група са напр. пирогроздена киселина, a-кетоглутарова киселина, оксалоцетна киселина; с алдехидна група - напр. полуалдехид на a-кетоглутарова киселина). Съществена роля играят киселини с две и повече карбоксилови групи. С две групи са напр. янтърна киселина,a-кетоглутарова киселина, оксалоцетна киселина, ябълчна и др.; с три карбоксилови групи и една хидроксилна е напр. лимонена киселина.

Фиг. 1-3. Примери за алифатни карбоксилови киселини с допълнителни функционални групи.

При оксо-киселините (напр. пирогроздена ) се наблюдава кето-енолна изомерия (тавтомерия (фиг. 1-4 ).

Фиг. 1-4. Кето-енолна тавтомерия при пирогроздена киселина. Вляво е кето-формата, а вдясно - енолната форма.

Някои киселини са производни на монозахариди, при които алдехидната група е окислена до карбоксилова. Те се наричат “онови” киселини (напр. глюконова киселина - виж фиг. 1-5) и заемат съществено място в метаболитните процеси.


Фиг. 1-5. Глюконова киселина - пример за "онови" киселини, производни на монозахариди.

Макар и по-рядко се срещат и ароматни карбоксилови киселини като бензоена, салицилова и канелена (фиг. 1-6), р-кумарова и др. Те са присъщи предимно на растителните организми.


Фиг. 1-6. Пример за ароматни карбоксилови киселини.

Поради голямото значение на карбоксилови киселини с амино-группи, и особено a-аминокарбоксиловите киселини, те ще бъдат разгледани отделно в т. 1.4.6.3.

1.4.6.2. Монозахариди (монози, захари)

Те са полихидроксимоноалдехиди и полихидроксимонокетони. Това е голяма група съединения от много съществено значение за процесите в биосферата. Според броя на въглеродните си атоми биват триози (с три), тетрози (с четири), пентози (с пет), хексози (с шест), хептози (със седем) атоми (фиг. 1-7). Най-застъпени в природата са пентозите и хексозите.


Фиг. 1-7. Пример за монозахариди с три, четири, пет, шест и седем въглеродни атоми, представени с проекциите на Fischer.

Познати са и различни производни на монозахаридите: аминозахари (фиг. 1-8), при които една от хидроксилните групи (най-често тази на второ място) е заместена с аминогрупа; дезоксизахари, при които една от хидроксилните групи липсва (напр. дезоксирибоза), карбоксилни производни, при които най-отдалечената от карбонилната група хидроксилна група е окислена до карбоксилова (уронови киселини).


Фиг. 1-8. Примери за аминозахари (глюкозамин), дезоксизахари (дезоксирибоза) и уронови киселини (глюкуронова киселина).

Познати са и монози с хидроксилна група, естерифицирана със сярна киселина (сулфатирана). Те, обаче, се третират като производни структури и обикновено се намират в състава на олиго- и полизахариди.

Изомерни форми

Монозахаридите съдържат асиметрични въглеродни атоми и показват оптична изомерия. Асиметричен въглероден атом е този, при който четирите му валенции са наситени с различни други групи. Съвременното название на асиметричен въглероден атом е “хирален атом", респ. “хирален център” (от гръцки “хеир” - ръка, длан). Съединения, които имат еднаква стуктурна формула, но различна пространствена конфигурация, се означават като стереоизомери.

Глицералдехидът и дихидроксиацетонът се разглеждат като най-нискомолекулни алдоза, респ. кетоза с биологично значение. Дихидроксиацетонът не притежава хирален център, а глицералдехидът има един хирален център и следователно две изомерни (енантиомерни) форми: D- и L-глицералдехид (фиг. 1-7), отнасящи се като огледални образи. (Наред с означенията D и L, използват се и означенията R (rectus, десен) и S (sinister, ляв) съгласно системата на Cahn-Ingold-Prelog).

Монозахаридите с повече от три въглеродни атома (триози) имат повече от един хирален център. Броят на възможните изомери на дадено съединение е равен на 2n, където n e брой на асиметричните атоми. Прието е тези изомери да се подреждат в две серии - D и L. При алдохексозите има четири хирални центра. Следователно при тях броят на възможните изомери е 16 (осем в D-серия и осем в L-серия). Кетохексозите притежават три хирални въглеродни атома и при тях броят на изомерите е осем. От D-серия са хексозите, при които конфигурацията на петия С атом (последният асиметричен С атом) е както при D-глицералдехида, от L-серия са хексозите, при които конфигурацията на петия С атом е както при L-глицералдехида. Т.е. водеща за определяне вида на един монозахарид се приема хиралността (асиметрията) при най-отдалечения от карбонилната група въглероден атом. С малки изключения всички природни монозахариди са от D-серия. Всички монозахариди от D серия се срещат в природата, но най-застъпени са: еритроза (алдотетроза), рибоза и дезоксирибоза (алдопентози), ксилулоза и рибулоза (оксопентози), глюкоза, галактоза, маноза и гулоза (алдохексози), фруктоза (оксохексоза), седохептулоза (оксохептоза).

Оптична активност
Енантиомерите, които са неразличими физически и химически, се отнасят различно, когато когато лъч на плоско-поларизована светлина се пропусне през разтвор на оптично активен изомер. Наличието на асиметрични атоми обуславя свойството оптична активност - способност да въртят равнината на поляризована светлина. Посоката и ъгълът на въртене се измерват с уред, наречен полярометър. Изомерите могат да бъдат дясновъртящи (+) или лявовъртящи (-). Няма обаче ясна зависимост между структурата на молекулата и посоката на въртене. Така че дадено съединение може да бъде D(+), D(-), L(+) или L(-). Смес от равни количества от D и L форми няма оптична активност, тъй като активностите на двата изомера се неутрализират. Такава смес се нарича рацемична. Обикновено ензимите различават и действат само на единия от двата изомера.

Полуацетални и полукетални форми

Известно е, че алкохоли могат да реагират с алдехиди и кетони, при което се получават съответно хемиацетали и хемикетали, както е показано на фиг. 1-9. По подобен начин в монозахаридите с повече от четири въглеродни атома хидроксилни групи могат да реагират с алдехидни групи (или кето-групи). Водороден атом от една от хидроксилните групи преминава към карбонилната група.Така се получават полуацетални и полукетални производни с циклична пръстенна структура (фиг. 1-10).


Фиг. 1-9. Възможности за получаване на полуацетали и полукетали.

Пръстените биват шест атомни (пет въглеродни и един кислороден хетероатом) или пет атомни (четири въглеродни и един кислороден хетероатом). Първите се наричат “пиранозни” (от структурата на хетеропръстенното съединение пиран), а другите се наричат “фуранозни” (от структурата на хетеропръстенното съединение “фуран”). Така например D-глюкозата в разтвор е над 99% под форма на D-глюкопираноза, а при фруктозата преобладава D-фруктофуранозната форма.


Фиг. 1-10. Примери за полуацетални и полукетални форми на хексози, представени в горния ред като Фишерови, а в долния ред като Хейуъртови проекции. Дадени са и пръстенните структури на пиран и фуран.

В действителност атомите (въглеродни и кислороден), които образуват пиранозните или фуранозни структури на захарите не лежат напълно в една плоскост. При шестатомния пиранозен пръстен са възможни две пространствени конфигурации на пръстена, обозначени като “вана” и “стол” (фиг.1-11). Енергетично предпочитаната конфигурация е тази на “стол”.


Фиг. 1-11. Пространствени конфигурации "вана" и "стол" за глюкопираноза.

При циклизирането се създава нов хирален център и съответно на това два полуацетални изомери. Новообразуваната полуацетална хидроксилна група при този център се отличава с по-висока химична реактивност и с по-особени биохимични отнасяния. В бихимията за нея се предпочита названието гликозидна хидроксилна група. Преминаването на карбонилната в полуацетална или полукетална форми е обратимо и се извършва спонтанно във воден разтвор. Обратимото преминаване на монозахаридите от карбонилна в полуацетална или полукетална форма има голямо значение в биохимията. При някои биохимични реакции монозахаридите се включват със своите карбонилни, а при други - със своите полуацетатни или полукетални форми. Вместо плоскостните Фишерови проекции (фиг. 1-9) за изписване на цикличните форми на монозахаридите се използват обикновено пространствените структури, известни като Хейуъртови проекции, или формули. При тях пръстенът се представя като хекса- или пентагонална форма, която се проектира под известен ъгъл спрямо плоскостта на екрана (листа). Връзките между въглеродните атоми, които се намират пред тази плоскост се представят по-удебелени. Хидроксилните групи в D-позиция лежат под плоскостта на пръстена, а тези в L-позиции - над плоскоста на пръстена. Лежащите извън пръстена въглеродни атоми, например шестият въглероден атом при D-глюкопиранозата, също се изписват над плоскостта на пръстена.

Алфа и бета аномери
Полуацеталната (гликозидната) хидроксилна група може да заема две позиции спрямо плоскостта на пръстена. За разлика от позициите на хидроксилните групи при останалите хирални центрове, които биват D и L, тези се бележат като a“, когато са под плоскостта на пръстена, или като “ b“, когато са над плоскостта. Тези две форми, наречени аномери, за разлика от останалите преминават спонтанно една в друга. Във воден разтвор се установява равновесие между карбонилната и двете полуацетални форми на захарите. Примери за a“ и “ b аномери има на фиг. 1-10.

Епимери

Това са изомери, които се различават по конфигурацията на хидроксилната група и водородния атом при втория или третия, или четвъртия С атоми на глюкоза. С най-голямо биологично значение са епимерите на глюкоза - галактоза и маноза (виж фиг. 1-7).

Алдо и кето-изомерия
Като примери могат да се посочат глицералдехид и дихидроксиацетон, глюкоза и фруктоза и др., които имат еднакви молекулни формули, но се различават по вида на карбонилната група - алдехидна или кето-група.

Захарите са най-предпочитаният от организмите материал за окислително разграждане, свързано с получаване на енергия в използваема форма. Фосфорилирани производни на монозахаридите участват във важни метаболитни пътища като гликолиза и пентозофосфатен път. Пентозите участват в образуване на нуклеозиди, нуклеотиди, нуклеинови киселини и важни коензими.

1.4.6.3. Алфа-аминокарбоксилови киселини

Това са съединения, при които първият по ред въглероден атом във въглеродния им скелет, обозначен като a-въглероден атом е свързан задължително с една аминна (наричана a-аминна) и една карбоксилна (наричана a-карбоксилна) група.

a-Аминокиселините притежават задължително (с изключение на глицина) най-малко един хирален център. Това е a-въглеродният атом. Съобразно с разположението на заместителите при тези атоми всяка a- аминокиселина ще се явява в две изомерни форми - D- и L-. Някои аминокиселини (напр. треонин, изолевцин) притежават и други хирални центрове. a-Аминокиселините имат голямо биологично значение. Много от тях изпълняват самостоятелни биологични функции в метаболизма. Но най-същественото значение е, че двадесет a-аминокиселини от L-стеричен ред са градивни единици (мономери) на белтъците във висшите организми, вкл. човек. Техните формули са представени на фиг. 1-12, а по-подробно са разгледани в точки 2.1.3 - 2.1.6.


Фиг. 1-12. Формули на двадесетте L-a-аминокиселини, изграждащи белтъците. Освен названията са дадени приетите трибуквени съкращения на кирилица и еднобуквените съкращения на латиница.


Фиг. 1-12. Формули на двадесетте L-a-аминокиселини, изграждащи белтъците. Освен названията са дадени приетите трибуквени съкращения на кирилица и еднобуквените съкращения на латиница.

Тези двадесет аминокиселини се наричат кодирани, защото за тях има специфични кодони в генома. В полипептидните вериги на белтъците се срещат и още няколко аминокиселини като например хидроксипролин, хидроксилизин и др., които не са кодирани; те се образуват чрез допълнителни следсинтетични биохимични операции в полипептидните вериги. Една от кодираните аминокиселини, а именно пролинът, е всъщност циклична иминокиселина.

В разтвор при неутрална среда a-карбоксилната и a-аминогрупите на аминокиселините се йонизират, т.е. аминогрупата е протонирана и получава положителен електричен заряд, а карбоксилната - е депротонирна и получава отрицателен електричен заряд. В такава среда аминокиселините се явяват както близначни (”цвитер”) йони (фиг. 1-13). Съединения като аминокиселините, които притежават както базични така и кисели групи, се наричат амфотерни. Амфотерните своства на аминокиселините определят техния буферен капацитет в широк диапазон от рН. Зарядовите свойства на аминокиселините са разгледани в т. 2.1.6.

 
Фиг. 1-13. Цвитерионна форма на аланин, в която са йонизирани, както a-карбоксилната група, така и a-амино- групата.

Макар и рядко в организмите се срещат и аминокиселини от D-серия, но обикновено включени в производни структури, например D-аланин в структурата на бактерийния муре

1.4.6.4. Други основни органични структури

Освен мастни киселини, монозахариди и a-аминокиселини в природата се срещат и много други органични съединения - основни структури. В свободен вид те се намират сравнително малко, а обикновено са включени в производни структури. Изпълняват също така съществени биологични функции.

1) Алифатни алкохоли, алдехиди, кетони и амини
Някои от тях се намират в свободно състояние и изпълняват съществени биологични функции. Поливалентни алкохоли се получават като производни на монозахариди (глицерол, ксилитол, сорбитол и др.) - виж фиг. 1-14.


Фиг. 1-14. Примери за поливалентни алифатни алкохоли.

От карбонилните съединения (фиг. 1-15) се срещат ацетон, ацеталдехид и техни фосфорилирани производни и др. Особено внимание заслужава групата на т. нар. биогенни амини: хистамин, серотонин и др. (фиг. 1-15).


Фиг. 1-15. Примери за алдехиди, кетони и амини.

2) Изопренови (пренилови) производни

Това е много разпространена група съединения както при растителни и животински организми, така и при микроорганизми. Третират се като полимери (а неполикондензати) на изопрен (пренил). Такива са терпените, застъпени във висшите растителни организми, каротиноидите, чието производно е аксерфтолът (витамин А или ретинол) и неговото алдехидно производно ретинал (фиг. 1-16).


Фиг. 1-16. Формули на изопрен, аксерофтол (витамин А) и 11-транс-ретинал.

Най-разпространената група изопренови производни са стероидите. В основата на тяхната структура лежи циклопентаноперхидрофенантреновият пръстен (фиг. 1-17). Тук принадлежат животинските стероли (холестерол и неговите производни жлъчни киселини, стероидни хормони и др.), растителните стероли (ергостерол и негови производни като сърдечните гликозиди, сапонините и стероидни алкалоиди и др.).


Фиг. 1-17. Формули на холестерол и ергостерол, производни на циклопентаноперхидрофенантреновия пръстен.

3) Ароматни съединения се срещат сравнително по-рядко в организмите. Най-застъпени са три от кодираните аминокиселини: фенилаланин, тирозин и триптофан (фиг. 1-12). По-голямо разнообразие от ароматни съединения има в растителните организми (бензоена киселина, р-аминобензоена киселина - съставка на фолиевите киселини), фенол, крезол, салицилова киселина, канелена киселина, р-кумарова киселина (фиг. 1-6) и много други. Ароматни пръстени се съдържат в много производни структури, също така застъпени в растенията като дъбилни вещества (танин), флавоноиди, лигнини и лигнани и др.

4) Карбоциклени съединения, включително хидроароматни се срещат рядко в живата матрия. От по-съществено значение е групата на циклитолите, например инозитолът (фиг.1-18).


Фиг. 1-18. Формула на инозитол.

5) Хетероциклени съединения
Те са сравнително по-разпространени. Към тях принадлежат както основни, така и производни органични структури. В природата се срещат съединения, съдържащи почти всички познати на органичната химия хетеропръстени (фиг 1-19). На първо място и като особено важни трябва да се споменат пуриновите и пиримидинови производни, съставки на такива много съществени производни структури като нуклеозидите, нуклеотидите и нуклеиновите киселини. Голям брой кофактори съдържат в структурата си хетеропръстени; например никотинамид динуклеотид (пиридинов пръстен), фолиева киселина (птеридинов пръстен), биотин (тиофенов пръстен), тиаминпирофосфат - производно на витамин В1 (имидазолов и тиазолов пръстени), пиридоксол или витамин В6 (пиридинов пръстен) и др. Две от кодираните аминокиселини съдържат хетеропръстени: хистидин (имидазолов пръстен) и триптофан (индолов пръстен). Цикличните иминокиселини пролин и хидроксипролин, както и порфирините съдържат в структурата си пиролов пръстен.


Фиг. 1-19. Формули на хетероциклени пръстенни системи (основни съединения).

1.4.7. Свързване на основните органични структури. Производни органични структури

В природата броят на органичните съединения с производни структури е значително по-голям. Това се дължи на различните възможности за свързване на основните структури помежду им, на многобройните комбинации от свързване на такива структури, както и на възможността да се свързват не само две, но и много по-голям брой такива съединения и по този начин да се получават молекули със значително по-високи молекулни маси. Освен това съединенията - производни структури съставляват значително по-голяма част от масата на организмите. Причината е, че голяма част от тези структури се задържат по-продължително време в организмите, като изпълняват структурообразувателни функции, или се натрупват като хранителни (енергийни) резерви. Основните органични структури се свързват помежду си по два принципно различни механизма, известни в органичната химия като полимеризация и кондензация.

Полимеризацията се дължи най-често на разкъсване на двойна връзка. Тя следователно изисква ненаситени съединения. При разкъсване на двойната връзка се освобождават две валенции, които могат да се наситят чрез свързване с други подходящи органични структури. Такъв пример е представен на фиг. 20. Разкъсването на двойни връзки се извършва обикновено чрез редукция. В организмите за това съдействат ензими от групата на оксидоредуктазите. Получените съединения се наричат полимери (в организмите биополимери). Типични органични полимери в живата материя са лигнините, кондензираните танини и др., представени предимно в растителните организми. Такива полимери не се хидролизират и за това се причисляват само условно към производните структури (виж пренилови полимери и стероиди).


Фиг. 1-20. Пример за полимеризация.

Кондензацията е процес, при който основните органични структури се свързват чрез отделяне на молекула вода (понякога в организмите това става чрез отделяне на фосфорна киселина) между реагиращи помежду си функционални групи. Получените съединения са поликондензати, но в биохимията и за тях е възприет и широко употребяван, макар и неправилно, терминът полимери, респ. биополимери.

В живата природа са познати четири начина за свързванe чрез кондензация, при които се получават и четири типа връзки: гликозидна, естерна, киселинноамидна (в някои случаи наричана пептидна) и киселинноанхидридна. Съответно на това се получават и четири типа производни полимери (респ. поликондензати): гликозиди, естери, киселинни амиди (респ. пептиди) и киселинни анхидриди.

1) Киселинноамидна (пептидна) връзка. Киселинни амиди (пептиди)
Тя се получава при обезводняване на карбоксилна и амино-групи. Понякога вместо амино-група може да участва и амоняк (фиг. 1-21).


Фиг. 1-21. Образуване на киселинно-амидна връзка.

Когато киселинноамидната връзка се образува между алфа-амино и алфа-карбоксилната група на две алфа-аминокиселини, тя се нарича пептидна връзка (фиг. 1-22). Свързаните с пептидна връзка амино- и карбоксилна групи образуват пептидна група, която е основен структурен елемент при олиго- респ. полипептиди и белтъци. Тази група има особени свойства, които имат огромно значение за биологичните отнасяния на белтъчните молкули и ще бъдат разгледани в главата за структура на белтъците.


Фиг. 1-22. Взаимодействие на алфа-карбоксилна и алфа-амино-групи на две алфа-аминокиселини
за образуване на пептидна връзка.

2) Естерна връзка
Естерната връзка е много застъпена в природата. Естерите са кондензати, получавани от обезводняването на алкохолна група с различни киселини: карбоксилови, фосфорна, сярна и др. (фиг. 1-23). Естери с карбоксилови киселини са например триацилглицеролите, восъците и етеричните масла. Естерна връзка има и при стероидите - например естерифициран с мастна киселина холестерол.


Фиг. 1-23. Пример за естерна връзка (между карбоксилова киселина и алкохол ) и формули на триацилглицерол и естерифициран холестерол.

Други естери са представени на фиг. 1-24. Много важна роля имат естерите на фосфорната киселина. Тя е триосновна, но в природата се срещат само нейни моно- и диестери. Моноестери на фосфорната киселина с голямо биологично значение са фосфорилираните монозахариди (например глюкозо-монофосфати). Естери с фосфорна киселина съдържат различните глицеролфосфолипиди - например лецитините. Нуклеотидите са моноестери на нуклеозидите, но при изграждането на полинуклеотидните вериги на нуклиновите киселини връзките между отделните нуклеотиди са фосфодиестерни.


Фиг. 1-24. Примери за естери на фосфорната киселина.

3) Гликозидна връзка
Тя се получава при обезводняване на гликозидната (полуацеталната) хидроксилна група на монозахарид с всякаква друга хидроксилна, тиолова, или циклична аминогрупа. Това “задължава” въглехидратите при образуването на гликозидни производни да реагират със своите циклични (полуацетални) структури. Най-застъпени в природата са гликозидните връзки с хидроксилни групи. Това са така наречените кислород-гликозиди (фиг. 1-25). Кислород-гликозидни са връзките при всички олиго- и полизахариди.


Фиг. 1-25. Образуване на O-гликозидна връзка.

Най-разпространените дизахариди като обикновената захар (захароза - фиг. 1-26), и представените на фиг. 1-27 млечна захар (лактоза) и малцовата захар (малтоза) притежават такива връзки. При захарозата гликозидната връзка се получава от обезводняването на две полуацетални хидроксилни групи, затова тази захар няма редуктивни свойства (захари от трехалозов тип). При другите два дицахарида остава свободна гликозидна хидроксилна група, която обуславя редуктивни свойства. Тази гликозидна хидроксилна група може да заема както a така и b позиция.


Фиг. 1-26. Формула на разпространения дизахарид захароза (нередуцираща захар поради свързване на двата карбонилни С атоми). Систематичното название е O- a-D-Глюкопиранозил-(1-->2)- b-D-фруктофуранозид.

Фиг. 1-27. Формули на дизахаридите лактоза и малтоза (редуциращи захари поради наличие на свободна гликозидна хидроксилна група, която може да бъде a или b).

Когато кислород-гликозидната връзка се образува с немонозахаридни хидроксилни групи, се получават хетерозиди; при тях невъглеродната съставка се нарича агликон. Такива съединения са например сърдечните гликозиди (строфантин), някои стероиди, стрептомицинът и др.

Към азот-гликозидите принадлежи важната група на нуклеозидите (фиг. 1-28), съставки на нуклеотидите, нуклеиновите киселини и други биологично активни съединения. Сяра-гликозидите се срещат по-рядко. Те се получават при обезводняване на полуацетални с тиолови групи.


Фиг. 1-28. Формули на нуклеозиди, съдържащи N-гликозидна връзка.

4) Киселинно-анхидридна връзка

Тя се получава при обезводняване на две химични групи, които са склонни да се депротонират при биологични условия, т.е. групи с “киселинен" характер (фиг.1-29).

Фиг. 1-29. Примери за съединения с киселинно-анхидридна връзка.

Такива са съединенията, получавани от обезводняване на карбоксилна група с фосфорна киселина. Пирофосфорната киселина, неорганично съединение, се получава при обезводняване на две молекули ортофосфорна киселина и също притежава киселинно-анхидридна връзка. Киселинно-анхидридните връзки са твърде нестабилни. Съединенията, които ги съдържат, се наричат макроергични съединения; това са твърде реактивоспособни молекули, които заемат особено място в биохимичната енергетика; ще бъдат разгледани по-обстойно там. Най-съществени представители на тази група производни структури са аденозинтри- и аденозиндифосфорната киселина (АТФ и АДФ), креатинфосфатът, фосфоенолпируватът, ацилфосфатите (на първо място ацетилфосфатът) и др. (виж структурите им в същия раздел).

1.4.8. Комплексни органични съединения. Биологични макромолекули

Органичните съединения с производни структури се образуват обикновено от свързването на еднотипни, а в някои случаи и идентични основни структури (мономери). Такива молекули съдържат и еднотипни връзки, напр. само пептидни, само гликозидни и т.н.

В природата обаче се срещат и производни структури, изградени от свързването на разнородни мономери. Така например глицерофосфолипидите (лецитини и др.) съдържат не само карбоксилестерни, но и фосфоестерни връзки.

Някои производни структури на въглехидратите съдържат освен монозахаридни единици, още и нуклеозидфосфати (напр. уридиндифосфатглюкоза), а някои и липидни компоненти и т.н. При тях, освен гликозидни, се съдържат още и фосфоестерни, карбоксилестерни и други видове анхидридни връзки. Такива съединения се наричат комплексни. Говори се напр. за комплексни захари, комплексни липиди и т.н. По правило комплексните съединения съдържат повече от един тип връзки.

Свързването на основните химични структури в бисферата води до образуване на молекули с по-високи молекулни маси. Особено значение от биологична гледна точка имат онези от тях, чиято молекулна маса надвишава 8000 - 10 000. Това са биологичните макромолекули. С малки изключения те се получават формално чрез кондензация на основните структури и затова могат да бъдат наречени биополикондензати, но в биохимичната литература за тях се е утвърдил терминът биополимери, макар и не съвсем издържан от химична гледна точка. От структурна гледна точка макромолекулите не се отличават рязко от аналогичните на тях полимери с по-ниска молекулна маса - напр. белтъците от полипептидите. Условната граница и големината на молекулната маса отбелязва предела, над който тези молекули имат достатъчни размери, за да образуват колоидни разтвори, без да се асоциират.

Една част от биологичните макромолекули са изградени чрез свързването на еднотипни, в някои случаи идентични основни структури. Тази група - хомополимерите играят най-често ролята на резервни хранителни вещества, на защитни или скелетни структури. Например целулозата, образувана от свързването на голям брой глюкозни мономери с b-глюкозидни връзки, е типичен хомополимер. Резервен хомополимер при човека е гликогенът, образуван от свързването на голям брой глюкозни мономери с a-1,4-глюкозидни връзки.

Когато градивните единици при полимерите са еднотипни, но не идентични, се говори за хетерополимери. Полипептидните вериги на белтъците са типични хетерополимери, защото са изградени от еднотипното свързване на двадесет различни аминокиселини.

Въпреки огромното привидно разнообразие в биосферата се намират само пет основни типа биологични макромолекули: полимери на въглеводородите, полимери на фенолите, полизахариди, белтъци и нуклеинови киселини. Първите два типа не са предмет на този курс, а структурата и обмяната на последните три типа са разгледани в следващи глави.

1.5. Общ поглед върху устройство и функции на клетка от животински произход

Молекулите, които изграждат клетката, не се намират безпорядъчно разпръснати в нея. Основните органични структури изграждат производни структури. Биополимерите със своята склонност към конюгиране и агрегиране играят централна роля при създаване на закономерна и стройна вътреклетъчна организация (фиг. 1-30). Малка част от тях се намират молекулно диспергирани в течната среда на клетката, а повечето са свързани помежду си с други големи и малки молекули по строго определен начин, изграждайки многомолекулни структури. Тези структури имат значително по-големи размери от размерите на изграждащите ги молекули и вече могат да бъдат наблюдавани с електронен и дори със специален или обикновен светлинен микроскоп. Това са субклетъчните органели (фиг. 1-31), всяка от които е ограничена от мембрана. Тук спадат плазмена мембрана, ядро, митохондрии, ендоплазмен ретикулум, апарат на Голджи, лизозоми, пероксизоми. Рибозомите, цитоскелетът и цитозолът са други важни компоненти, които могат да се изолират като субклетъчни фракции. Чрез координираните функции на тези субклетъчни органели се осъществява дейността на клетките в човешкия организъм.


Фиг. 1-30. Йерархия на вътреклетъчната организация.

Фиг. 1-31. Схематично представяне устройството на клетка от животински произход.

Субклетъчните органели могат да се изолират чрез клетъчно фракциониране и утаяване на различните фракции във високоскоростни центрофуги (диференциално центрофугиране).

Кратък преглед на основните функции на субклетъчните органели е представен в табл. 1-3.

Табл. 1-3. Функции на субклетъчните органели.

Табл. 1-3. Функции на субклетъчните органели.

1.5.1. Мембрани. Компартментализация

Най-честа срещаната многомолекулна структура в клетката е мембраната. Клетката притежава много мембрани: клетъчна мембрана, която ограничава клетката от околната й среда; ядрена мембрана, ограничаваща ядрото от протоплазмата; мембрани,ограничаващи и структурно оформящи митохондриите; ергастоплазмени мембрани, които образуват мрежа от каналчета в цитоплазмата (ендоплазмен ретикулум); мембрани, заграждащи различни вакуоли и формиращи апарата на Голджи, ограничаващи лизозомите и пр.

Всички мембрани, независимо от разнообразието на функциите, които изпълняват, си приличат по състав и устройство. Те са изградени от два основни компонента - белтъци и липиди. Съотношението между тях обаче може да варира в твърде широки граници и изглежда, че тези вариации са свързани с функционалните особености на мембраните. Могат да бъдат разграничени три типа мембрани:
1) с високо липидно съдържание - около 80% (такива са например миелиновите мембрани при нервните клетки);
2) със средно липидно съдържание - до 50% (такива са напр. повечето външни клетъчни мембрани, външните митохондрийни мембрани и мембраните, които образуват каналчетата на ендоплазмения ретикулум);
3) с ниско липидно съдържание - под 30% (напр. вътрешните митохондрийни мембрани, мембраните на бактериалните протопласти и др.).

От различните видове липиди в мембраните са застъпени най-много фосфолипидите (лeцитини и кефалини). Освен тях обаче в различни количества се срещат и други липиди - холестерол, висши мастни киселини, гликолипиди и пр. Например миелиновите мембрани се характеризират с високо холестеролово съдържание и наличие на гликолипиди, докато вътрешните митохондрийни мембрани почти не съдържат холестерол.

Мембраннитe белтъци са все още недостатъчно проучени. Изглежда, че значителна част от тях изпълняват специфични ензимни функции. Така например вътрешните митохондрийни мембрани съдържат пълни комплекти от ензимите, провеждащи електронния транспорт по дихателните вериги и окислителното фосфорилиране, свързано с този транспорт. Те съдържат и други ензимни комплекси. Освен такива специфични белтъчни молекули мембраните съдържат и структурни или т. нар. инертни белтъци. Такива например са били изолирани от митохондрии - неразтворими в неутрална, обаче разтворими в леко кисела и леко алкална среда; с високо изразено сродство към липиди.

Към мембраните могат да бъдат прикрепени стабилно или по-слабо и други високо- и нискомолекулни вещества - кофактори, полизахариди и пр. Особено много полизахариди се съдържат в бактериалните мембрани и въобще във външните клетъчни мембрани.

Под електронен микроскоп всички мембрани най-общо изглеждат еднакво: два тъмни слоя ограждат един централен светъл слой. И при багрене този централен слой остава неоцветен - има малък афинитет към багрила. Мембраните се отличават малко по своята дебелина - тя варира между 6 и 10 нм. Тънки са вътрешните митохондрийни мембрани - около 5,5 нм. Ядрените мембрани имат дебелина около 7,5 нм и пр.

Най-задоволителен засега е предложеният през 1972 г. модел на Сингер и Никълсън (фиг.1-32). Два слоя фосфолипидни молекули образуват основата на мембраната. Хидрофилните им участъци са насочени навън, а хидрофобните към вътрешността. Преобладава фосфатидилхолинът, но освен него в различни съотношения според вида на мембраната участвуват фосфатидилетаноламин, фосфатидилсерин, сфингозинфосфатиди и др. В някои типове мембрани (цитоплазмени, миелинови) се съдържат гликолипиди и холестерол.


Фиг. 1-32. Схематично представяне структурата на мембрана.

Специфичността на мембраната се обуславя най-вече от включените в нея белтъци. Белтъчните молекули са "потопени" в липидния слой. Някои се подават към външната повърхност, други - към вътрешната повърхност, а трети (с удължена структура) пронизват целия мембранен слой и се показват от двете страни. Обикновено азотният край на полипептидните вериги се намира на повърхността на мембраната, а въглеродният край е "заровен" в липидния слой. Някои от мембранните белтъци са гликопротеини. Такъв например е гликофоринът, изолиран от еритроцитна мембрана на бозайници. Той пронизва мембраната, но целият му въглехидратен компонент (както това е и при всички останали мембранни гликопротеини) се намира на външната повърхност на мембраната. Друг белтък, който също пронизва еритроцитната мембрана, е свързан с транспорта на аниони през мембраната. Той е димер. Между двете субединици се образува "канал", през който вероятно преминават анионите.

Някои белтъци са прикрепени сравнително по-слабо към вътрешната повърхност на мембраната. Те се наричат периферни белтъци. Периферните белтъци се отмиват сравнително лесно от мембраните. Такива са някои ензими (напр. глицералдехид-3-фосфатдехдрогеназа) или белтъци, които имат контрактилни свойства, подобни на мускулните белтъци актин и миозин, напр. спектрин, мембранен или цитоплазмен "актин". На тях се дължи възможността мембраните да се свиват и разпускат. Характерен белег на мембраните е тяхната асиметрия - двете им повърхности (вътрешна и външна) не са равнозначни и по състав, и функционално. Това се дължи преди всичко на нееднаквото разположение на белтъци към вътрешната и външната мембранна повърхност. Но и липидният състав на двата липидни полуслоя на мембраните не е еднакъв. Обикновено във външния полуслой преобладават липидни молекули, чиято хидрофилна "глава" е по-голяма, напр. сфингомиелин и фосфатидилхолин.

Мембранният модел на Сингер и Никълсън е наречен "течно-мозаичен". Гъстотата на мембраната е от 100 до 1000 пъти по голяма от тази на водата. По тази причина и главно заради най-общо хидрофобния й характер тя се разграничава като фаза. Въпреки това тази гъстота все още позволява, макар и затруднени, латерални движения на липидните и особено на белтъчните й компоненти. Някои белтъци могат да извършват и ротационни движения, което е свързано с функциите им да провеждат активен транспорт на йони и молекули. Течно-мозаичният модел обяснява за сега най-задоволително повечето свойства на биологичните мембрани - електричните им отнасяния, асиметричността им, различната им дебелина, разнородното липидно и белтъчно съдържание; служи като добра основа за обяснение на явленията на мембранен транспорт.

Характерна черта на мембраните е тяхната непрекъснатост. Те образуват повърхности от мехурчест или тръбен тип, като заграждат пространства - сферични, елипсоидни или каналчести. Така мембраните изграждат вътреклетъчни образувания със специфични биологични функции - митохондрии, ядра, ергастоплазматични каналчета и др. Те разделят клетката на отделения (компартменти) със специфичен състав и различна метаболитна активност. В тях се извършват различни, понякога противоположни, но координирани химични процеси - синтеза и разграждане, естерификация и хидролиза, окисление и редукция. Това разделяне на клетката на компартменти чрез мембрани се нарича компартаментализация. Компартаментализацията позволява синхронизация и строга регулация на процесите в клетката (виж също т. 10.1.4).

Когато мембраните се разкъсват напр. чрез третиране с ултразвук, сегментите "се съшиват" така, че отново се образуват мехурчета.

Основна функция на мембраните е да ограничават или улесняват преминаването на веществата от една в друга част на клетката или от външната среда в клетката. Тази им способност се проявява по разнообразен начин: непропускливост или ограничена пропускливост за някои молекули или, обратно, активно натрупване на други - създаване на концентрационен градиент. Тази функция на мембраните се мени в широки граници, като е подложена на контрол. Изглежда, че мембранната асиметрия има съществено значение за насочения (векторен) транспорт на молекули и йони през мембраните. Към мембраните са прикрепени ензимни ансамбли, които провеждат сложни, многостъпални биохимични процеси. Голямо количество еднородни ансамбли, разположени върху една мембрана позволяват мултиплицирането и синхронизирането на биохимичните процеси. Някои специализирани мембрани поддържат или генерират електрични потенциали, свързани например с провеждането на дразнения при нервните клетки.

Клетъчната мембрана (в животински организми се използва и терминът "плазмена мембрана") има типичния липопротеинов строеж. Клетъчните мембрани са с избирателна пропускливост. Част от мембранните белтъци са транспортни белтъци (пасивни канали и помпи), които позволяват пренос на вещества отвън-навътре и обратно. Други белтъци имат различни функции - някои са ензими, други са структурни белтъци, от които зависи формата или възможността за движение. Има и рецепторни белтъци, които разпознават и свързват сигнални молекули от външната страна и предават сигнала навътре в клетката.

1.5.2. Транспорт през мембраните

Хидрофобните бариери, които мембраните оформят около клетките или субклетъчните органели, не позволяват на полярни вещества да излизат или влизат. Но мембраните не са просто прегради. Те са високоспецифични посредници между клетката и околната среда или между органелите и обкръжението им. За да съществуват, клетките трябва непрекъснато и селективно да поемат вещества от външната среда и да изхвърлят свои вещества в тази среда. Това се осъществява чрез транспортни механизми за пасивен или активен транспорт.

При пасивния транспорт веществата се движат по концентрационен градиент от място с по-висока концентрация към място с по-ниска концентрация или по електрохимичен градиент от място, където веществото е с по-висок заряд към място с по-нисък едноименен заряд или пък към място, където противоположният заряд е по-висок. Пасивният транспорт включва проста дифузия през мембраната (фиг. 1-33) и улеснена дифузия през мембранни канали (фиг. 1-34). Мембранните канали могат да бъдат отваряни или затваряни в отговор на свързване на регулаторни молекули или промяна във волтажа.



Фиг. 1-33. Пасивен транспорт чрез проста дифузия.
   

Фиг. 1-34.
Пасивен транспорт през мембранни канали
(улеснена дифузия).

Малките незаредени молекули на кислорода, водата и СО2 и хидробни вещества (напр. стероидни хормони) минават през мембраните чрез проста дифузия. Повечето клетки поемат глюкоза чрез пасивен транспорт. Концентрацията на глюкоза в извънклетъчната среда е по-висока в сравнение с вътреклетъчната, където глюкозата бързо се включва в метаболизма. АДФ също се пренася в митохондриите пасивно в обмен на АТФ. По същия начин Cl- се обменят за HCO3-.

Транспортните белтъци, участващи в пасивен или активен транспорт, имат специфични свързващи места за определени вещества. Свързването на веществото от едната страна на мембраната, променя конформацията на белтъка и това позволява веществото да бъде пренесено и освободено от другата страна на мембраната (фиг. 1-35). Когато свързващите места се заемат и системата е наситена, скоростта на транспорт достига максималната скорост. Инхибиторни вещества могат да снижат скоростта на транспорт като директно блокират свързващите места или като взаимодействат с транспортните белтъци в други места и променят тяхната конформация.


Фиг. 1-35. Действие на мембранните транспортни белтъци при пасивен транспорт.

Активният транспорт представлява движение на вещество срещу химичния или електрохимичния градиент, което изисква разход на енергия (хидролиза на АТФ - виж глава "Биоенергетика") - виж фиг. 1-36. За разлика от простата дифузия, не изискваща специфични транспортни белтъци, те са абсолютно необходими за осъществяване на активен транспорт.


Фиг. 1-36. Активен транспорт.

Концентрациите на Na+ и K+ във вътреклетъчната и извънклетъчната течности се поддържат чрез ензимна система за активен транспорт, наречена Na+,K+-АТФаза или Na+,K+-помпа (фиг. 1-37). Тази именно система изразходва около една трета от енергията, необходима за базалния метаболизъм при човека (виж т. 19.2.13).


Фиг. 1-37. Действие на Na+,K+-АТФаза (Na+,K+ помпа).

Вторичен активен транспорт се извършва, когато веществото се транспортира срещу градиент, едновременно спрегнато с транспорт на друго вещество по градиент чрез активен транспорт. Пример за такъв вид транспорт е усвояване на глюкоза в клетките на проксималните бъбречни тубули или чревния епител успоредно с Na+ (симпорт - и двете вещества се движат в една посока). Възможен е и антипорт - напр. размяна на H+ и Na+ в бъбречния тубул при амониогенеза.

1.5.3. Ядро

Сред субклетъчните органели ядрото е с най-големи размери и може да се наблюдава с обикновен микроскоп. То съставлява средно 5 - 20% от масата на клетката. Основна функция на ядрото е да запазва, предава в потомството и използва за синтеза на белтъци генетичната информация на клетката, фиксирана в специфичните структури на ДНК. Бактериите (прокариотите) нямат морфологично обособени ядра (ограничени с ядрена мембрана), но също така съдържат ДНК с генетична функция, които се струпват през определен период от развитието на микроорганизма в морфологично определени структури.

Ядрото на почиващи клетки (които не са в процес на делене) съдържа едно или две морфологично обособени ядърца (нуклеоли) и е ограничено от цитоплазмата с двойна мембрана с дебелина 20-30 nm. Ядрото е изпълнено с основна маса - ядрен сок - нуклеоплазма, който изглежда леко зърнест под електронния микроскоп. Външната ядрена мембрана е свързана с ендоплазмения ретикулум и съдържа рибозоми. Пори (с дебелина 20-40 nm) в двете мембрани позволяват комуникация между нуклеоплазмата и цитоплазмата. Пространството между двете мебрани е свързано с вътрешността на ендоплазматичните каналчета. Така ядрото, въпреки че е разположено във вътрешността на клетката, изглежда да има пряка връзка с клетъчната околност.

Ядрото съдържа почти цялата ДНК на клетката и част от РНК (съотношението между ДНК и РНК е около 9:1 за чернодробни клетки). Освен ДНК, специфични за ядрата са и алкални нискомолекулни белтъци (хистони) и различни други белтъци. При делене ДНК с част от ядрените белтъци се групират в добре оформени нишковидни образувания - хромозоми. В почиващата клетка ДНК-молекулите се разпръскват в ядрената субстанция и образуват ядрения хроматин.

Ядърцата имат по-голяма плътност от нуклеоплазмата. Те са богати на РНК. Ядрото не притежава ензимни системи, които да окисляват субстрати, но в него се синтезират изцяло необходимите за клетката НАД и НАДФ.

1.5.4. Митохондрии

Митохондриите са видими под електронен и дори с обикновен микроскоп. Имат среден диаметър от 0,5 до 2 mи са от сферични до силно удължени. Ограничени са с двойна мембрана (фиг. 1-38). Външната мембрана е свободно пропусклива за малки молекули и йони.


Фиг. 1-38. Схематично представяне структурата на митохондрии.
1 - външна мембрана, 2 - вътрешна мембрана, 3 - междумембранно пространство, 4 - кристи (огъвания на вътрешната мембрана, 5 - матрикс.

Вътрешната мембрана се вгъва към вътрешността на митохондрия, образувайки напречни преградки (кристи). По такъв начин нейната повърхност е значително увеличена. Митохондрийните мембрани съдържат много фосфолипиди, но са бедни на холестерол. Вътрешната мембрана е непропусклива за повечето малки молекули и йони, включително и H+. Тя съдържа ензими и други фактори за пренасяне на електрони и свързаното с това окислително фосфорилиране (ензимни комплекси І - ІV от дихателната верига, АДФ-АТФ транслокази, АТФ синтаза и други мембранни преносители). В митохондриите се генерира преобладаващата част от необходимите за работата на клетката макроергични връзки. Затова на митохондриите се гледа фигуративно като на енергетичните централи на клетката.

Пространството, затворено между двете мембрани, е бедно на белтъци и съдържа нискомолекулни съединения - кофактори и субстрати на биологичното окисление.

Пространството, заградено от вътрешната мембрана, се нарича матриксно пространство. То е изпълнено с богата на белтъци течност. Съдържа пируватдехидрогеназният комплекс за окислително декарбоксилиране на пируват, ензимите на цитратния цикъл, ензимите на b-окислението на мастни киселини, аминоацидо оксидази, много други ензими, АТФ, АДФ, неорганичен фосфат, Mg2+, Ca2+, K+ и много други разтворими метаболити. Там има и митохондрийна ДНК и рибозоми. Митохондриите притежават известна генетична автономност - тази ДНК се използва за синтеза на белтъци. Но, освен това, много митохондрийни белтъци се кодират от ядрени гени, синтезират се в цитоплазмените рибозоми и след това се импортират в митохондриите чрез сложен процес.

Митохондриите са динамични структури. Техният брой и формата им се менят в зависимост от функционалното състояние на клетката.

1.5.5. Ендоплазмен ретикулум. Рибозоми

Ендоплазменият ретикулум е мрежа от мембранни тубули (каналчести образувания) в клетката. Към една част от тази мрежа има присъединени рибозоми - тя се нарича груб ендоплазмен ретикулум. Останалата част не съдържа рибозоми и се нарича гладък ендоплазмен ретикулум. При диференциално центрофугиране се изолират фрагменти от разкъсани мембрани, свързани с рибозоми - т. нар. микрозомна клетъчна фракция. От нея чрез третиране с агенти (напр. дезоксихолат), които разграждат липопротеиновите комплекси, и центрофугиране над 100 000 х g могат да се изолират рибозоми.

Ендоплазменият ретикулум има разнообразни функции. В него има ензими, участващи в липидния метаболизъм. В участъци, богати на гладък ендоплазмен ретикулум, се съхранява гликоген. В гладкия ендоплазмен ретикулум има окислителни ензими, и по-специално цитохром Р450-хидроксилазните системи, необходими за синтеза на стероидни хормони и обезвреждане на различни чужди за клетката вещества (лекарства, токсини и пр).

В рибозомите, прикрепени към грубия ендоплазмен ретикулум се синтезират различни белтъци. Тези белтъци навлизат в лумена на ретикулума, пренасят се до комплекса на Голджи и впоследствие се секретират извън клетката, или се насочват към лизозоми, или се включват в клетъчните мембрани.

Рибозомите са компактни частици, съставени почти само от РНК и белтъци. Затова се наричат рибонуклеопротеинови частици. В тях се синтезират белтъчните молекули. По-голямата част от рибозомите са прикрепени към външната повърхност на участъци от ендоплазмения ретикулум, но има и свободни рибозоми. Наблюдавани са и групи от рибозоми, свързани с информационна РНК (иРНК) - т. нар. полизоми. Молекулната маса на еукариотни рибозоми е около 4,5.106 (80 S), а молекулната маса на рибозоми от микроорганизми е около 3.106 (70 S). Съотношението между РНК и белтък при еукариотните рибозоми е около 1, а бактериалните рибозоми са по-богати на РНК - съотношението е около 2. Освен белтък и РНК, рибозомите съдържат магнезиеви йони и полиамини: спермин, спермидин, путресцин и кадаверин. Рибозоми има и в ядрото, в митохондриите и в хлоропластите. По-подробно тяхната функция ще бъде разгледана в глава "Синтеза на белтъци".

1.5.6. Комплекс на Голджи (Golgi) или апарат на Голджи

Комплексът (или апаратът) на Голджи (Golgi) се различава трудно от ендоплазмения ретикулум. Състои се от набор от плоски, леко извити удължени плоски весикули (цистерни) в цитоплазмата. До краищата на цистерните има голям брой други много по-малки сферични весикули (транспортни мехурчета ). Комплексът като цяло е асиметричен структурно и функционално. Вдлъбнатата (cis) страна е обърната към ендоплазмения ретикулум. Изпъкналата страна на комплекса се означава като trans-страна и е обърната към клетъчната мембрана.

Комплексът участва в модифициране на белтъци и разпределяне на тези белтъци за различни участъци на клетката (например лизозоми) или за извънклетъчната среда.

Белтъците, които се синтезират в рибозомите, прикрепени към грубия ендоплазмен ретикулум, се придвижват в мехурчета към cis-страната на комплекса и навлизат в неговия лумен. Там ензимите на Голджиевия комплекс добавят сулфатни, въглехидратни или липидни групи към някои аминокиселинни остатъци или удължават вече присъединени въглехидрати. Получаването на тези модифицирани белтъци (най-често гликозилирани белтъци или гликопротеини) и пакетирането им в транспортни мехурчета има за цел да улесни тяхната адресация към определени участъци в клетката. В комплекса на Голджи се синтезират и гликолипиди.

Весикулите, освободени от trans-страната на комплекса, могат да се придвижат до клетъчната мембрана. След сливане с нея, белтъците могат да бъдат освободени в извънклетъчното пространство (екзоцитоза), но гликопротеините и гликолипидите, които са били свързани с мембраната на весикулите, остават включени в клетъчната мембрана.

Комплексът на Голджи се багри селективно с осмиеви и сребърни соли.

1.5.7. Лизозоми и пероксизоми

Лизозомите са сферични мехурчета с размери на малки митохондри (диаметър около 1 mm). Оградени са от единична мембрана, която съдържа протонни помпи, поддържащи вътрешното рН около 5. Лизозомите съдържат ензими, които катализират хидролиза на белтъци до аминокиселини, полизахариди до монозахариди, нуклеинови киселини до нуклеотиди, липиди: триацилглицероли до мастни киселини и глицерол и фосфоглицероли до техните съставки. Получените продукти се изнасят в цитозола.

Лизозомната мембрана е непропусклива както за тези ензими, така и за макромолекулите в цитоплазмата. Затова при нормални условия лизозомната мембрана предпазва клетките от авторазграждане. То настъпва само при увреждане на лизозомните мембрани. Но извън лизозомите рН на цитоплазмата е около 7 и лизозомните ензими са по-неактивни. Това е второ ниво на защита на цитозолните макромолекули от авторазграждане.

Няколко важни механизми съществуват за внасяне на субстратите на лизозомните ензими в лизозомите: ендоцитоза (фагоцитоза или пиноцитоза) и друг строго контролиран процес на автофагия (самоизяждане). Големи частици като бактерии и дрожди се поглъщат от клетката чрез фагоцитоза (phago, ям, изяждам). Тези частици обикновено се свързват към мембранни рецептори, след което комплексът от частица и рецептор се придвижва към подплатени с белтъка клатрин ямки (вдлъбвания) в мембраната, които след включване на чуждия материал се затварят в мехурчета. Мембраната на такова мехурче се слива с мебрана на лизозома, получава се т. нар. вторична лизозома и лизозомните ензими осъществяват разграждането. Пиноцитозата (pino, пия) е подобен механизъм за ендоцитоза и смилане на по-малки частици като белтъци. При автофагията клетката оформя мембрана около вътреклетъчните компоненти, които подлежат на разграждане. Тази мембрана се слива с лизозомната мембрана и лизозомните ензими осъществяват разграждането.

Следователно лизозомите имат съществено значение за елиминиране на нежелани за клетката материали. В организма има специализирани фагоцитиращи клетки - макрофаги и полиморфноядрени левкоцити, които поглъщат патогенни микроорганизми и осъществяват защита срещу инфекции. Те също почистват клетъчни останки и мъртви клетки. Увредени клетки могат да оцелеят, включвайки автофагия, за да елиминират увредените компоненти. Чрез фагоцитоза се отстраняват клетки, които имат по-къс живот от този на целия организъм.

Фагоцитозата и автофагията се използват и в процеси на ремоделиране - възстановяване на променена функция - напр. възвръщане клетките на лактираща млечна жлеза към нелактиращо състояние.

В някои случаи в част от мембранните мехурчета остават неразградени материали. Тези мехурчета се означават като остатъчни телца. Някои клетки могат да изхвърлят тези телца чрез екзоцитоза, но в други те се натрупват с увеличение на възрастта.

Пероксизомите са цитоплазмени органели, близки по размер до лизозомите. Названието идва от факта, че те могат да образуват и да разграждат водороден пероксид. Последният се получава в пероксизомите при окислителното разграждане на аминокиселини, а също и при разграждането на висши мастни киселини с дължина на веригата над 20 С атоми до по-късоверижни мастни киселини. H2O2 е много токсичен, но той се използва в пероксизомите за други окислителни реакции или се разгражда под дйствието на ензима каталаза до вода и молекулен кислород.

1.5.8. Немебранни цитоплазмени компоненти (цитоскелет, цитозол)

Цитоскелетът е мрежа от три вида филаменти: микрофиламенти с диаметър 6-7 nm, междинни филаменти с диаметър 8-10 nm и микротубули с диаметър 22 nm.

Ролята на цитоскелета е да поддържа клетъчната форма, структурата на цитоплазмата, вътреклетъчния транспорт, клетъчната подвижност и клетъчното делене.

Всеки от тези филаменти се състои от белтъчни субединици, които могат да полимеризират в нишковидни образувания с определена дебелина. Филаментите не са постоянни структури. Те непрекъснато се разграждат до субединици и реасоциират във филаменти. Нямат ясно определено място в клетката. Напротив, то се променя при делене на ядрото (митоза), делене на клетката (цитокинеза), или промени във формата на клетката.

Микрофиламентите са изградени от актин. Междинните филаменти съдържат различни белтъци за различните клетки (виментин в ендотелни клетки в стените на кръвоносни съдове, дезмин в напречно набраздена мускулна тъкан и др.). Микротубулите са кухи цилиндрични образувания, чиито стени са изградени от 13 асоциирани a- b димери на белтъка тубулин.

За движението на вътреклетъчните органели по протежение на филаментите на цитоскелета са важни и други три белтъка с АТФ-азна активност, които използват химическата енергия на АТФ и я превръщат в механична енергия. Това са свързаните с цитоскелета миозин, динеин и кинезин, наричани молекулни мотори. Актин и миозин осъществяват мускулното съкращение в напречно-набраздени мускули. Динеин и тубулин участват в движението на ресни и камшичета. Кинезин е особено важен за движението на весикули и органели по протежение на микротубулите в невроналните аксони.

Цитозолът съдържа разтворимите клетъчни компоненти (субстрати, междинни метаболити, ензими). Тук се извършват разнообразни реакции и метаболитни процеси, предимно биосинтезни. Въпреки че цитозолът няма ясно изразена структура, поради високото белтъчно съдържание, цитозолът не е хомогенна смес от разтворими компоненти. Приема се, че и в него има функционално разделение (функционални компартменти).

Макар че повечето ензими са в разтворено състояние, когато се изолира цитозолът, възможно е в интактната клетка много от тях да са прикрепни хлабаво към мембранни структури или към компоненти на цитоскелета.

1.6. - 1.6.1. Основни положения в обмяната на веществата. Понятие за биологична обмяна

Съществуването и развитието на организма са невъзможни без непрекъсната взаимовръзка с околната среда. Организмът поема от нея вещества и енергия, които преобразува за свои нужди, но също така връща в околната среда преработени продукти и енергия. Именно това взаимодействие на организма със средата се нарича биологична обмяна. Тя е най-елементарната функция на живата материя. Най-сигурният начин, по който може да определим дали "едно късче материя е живо", е да проверим способно ли е то на биологична обмяна с околната среда.

Обмяната на веществата е свързана най-интимно преди всичко с основните общобиологични прояви на организмите - растеж, запазване на индивидуалността и развитие. Всяко нарастване на клетъчната маса е свързано с поемането на по-голямо количество вещество от средата и връщане на по-малко количество в нея, т.е. с положителен обменен баланс. Опити с белязани съединения (с радиоактивни изотопи) са показали по безспорен начин, че градивните вещества на клетките се обменят непрекъснато, т.е. молекулите, които съставят клетъчното тяло, непрекъснато се разграждат, а на тяхно място се синтезират нови - така след по-къс или по-дълъг период от време почти целият организъм се преизгражда от поетата отвън материя. И въпреки това той си остава същият. В основата на тази особеност лежи определена стабилност, определена способност към запазване на даден тип обменни процеси. С това биологичната обмяна на веществата се различава от обмяната, която съществува в неорганичната природа. Неживите тела взаимодействат с околната среда, поемат от нея вещества или търпят енергетични въздействия, но в резултат телата не се запазват, не се развиват, а се изменят и превръщат в други. Напр. варовиковите скали (калциев карбонат) непрекъснато се свързват с малките количества въглена киселина, разтворена в почвените води и се превръщат в калциев бикарбонат, който е по-лесно разтворим и се отнася - скалите се размиват, разрушават, изчезват.

1.6.2. Анаболитни и катаболитни процеси

Значителна част от веществата, които организмите поемат от околната среда, се оползотворяват. От биологична гледна точка това са т. нар. хранителни вещества. Попаднали в организма, хранителните вещества се подлагат на най-разнообразни химични превръщания, съвкупността от които се нарича междинна обмяна. Така организмите, респ. отделните клетки изграждат вещества, от които самите те са съставени, изграждат своята собствена маса, а също получават и енергията, необходима за изпълнение на жизнените им функции.

Клетките са изградени преди всичко от биополимери и липиди. Затова най-съществената страна на обменните процеси е синтезата на специфичните макромолекули, които изграждат организма. Чрез тях при растежа и развитието, при деленето и размножаването се запазват особеностите на организма, неговата индивидуалност.

Заедно със синтезирането на биополимери организмът синтезира и други, обикновено нискомолекулни съединения, които са необходими за различни биологични функции. Повечето от тези съединения са простетични групи и коензими и следователно са тясно свързани с катализирането на биохимичните процеси. Друга част участват активно при оползотворяване на енергията. Трети по съответни пътища водят до проявяване на различни физиологични ефекти (предаване на нервни импулси, свиване на кръвоносни съдове и пр.) или пък имат регулиращ обменните процеси ефект (хормони, ензимни ефектори, репресори и др.).

Превръщането на хранителните вещества в собствени, характерни за организма биополимери и в необходими за функционирането му активни съединения обхваща част от обменните процеси, наречени анаболитни. Тъй като при тях се изграждат специфични за организмите вещества и на първо място биополимери, те от биологична гледна точка представляват асимилационни процеси, защото водят до усвояване (асимилация) на чуждата за организма материя.

От химична гледна точка анаболитните процеси като цяло са синтезни. С малки изключения веществата, необходими за извършване на жизнените процеси, имат по-големи и сложни молекули от хранителните вещества, които постъпват в клетките. Изграждането им става в резултат на т. нар. биологични синтези (биосинтези). Анаболитните процеси като цяло са редукционни процеси. Биополимерите, а също и значителна част от нискомолекулните биологичноактивни вещества имат по-нисък редокс-потенциал от веществата, които клетката поема отвън. Затова при синтезите се срещат често редукционни процеси (стъпала), за които са необходими редуктори. Анаболитните процеси обикновено са ендергонични. Енергетичното съдържание на биополимерите и на повечето биологичноактивни вещества е по-високо от това на приетите хранителни съединения. Процесите на тяхната синтеза протичат, общо взето, с увеличение на свободната енергия. Следователно от термодинамична гледна точка биосинтезите като цяло не могат да протичат самоволно, а е необходимо да бъдат съчетани с процеси - източници на енергия.

Едновременно с анаболитните процеси в организмите се извършват непрекъснато процеси на разграждане на биополимерите и хранителните вещества до по-нискомолекулни съединения. Тези процеси обхващат втората страна от обмяната на веществата и се наричат катаболитни. Тъй като при катаболитните процеси се разграждат специфични за организмите съединения и на първо място биополимери, те се наричат дисимилационни, понеже чрез тях организмът превръща специфичните си молекули в общи за повечето или за всички организми.

Катаболитните процеси са процеси на разграждане на по-големи молекули до по-малки. Те са, общо взето, окислителни - при тях твърде често се срещат окислителни стъпала и продуктите на разграждането имат по-висок редокс-потенциал, отколкото изходните съединения. Най-сетне дисимилационните процеси са като цяло екзергонични - при тях се отделя енергия, те протичат с намаление в свободната енергия на системите и продуктите им са по-бедни на енергия. Твърде често по пътя на разграждането на веществата в организмите се получават и съединения с биологична активност. Биологичноактивни нискомолекулни вещество следователно може да се образуват в резултат както на синтезни процеси, така и на процеси на разграждане. Посредством процесите на разграждане организмите се освобождават непрекъснато от асимилираната в тях материя. Най-същественото значение на катаболитните процеси е това, че освободената при тях енергия се използва за нуждите на организма - за провеждане на ендергоничните синтези, за извършване на друг вид работа и т.н. Следователно най-общо катаболитните процеси са необходимо допълнение на анаболитните процеси. Анаболитните и катаболитните процеси, асимилационните и дисимилационните процеси са противоположни, но свързани неразривно едни с други. Не е възможно да се представи съществуването на организъм, който да синтезира веществата, без обаче да ги разгражда.

1.6.3. Обменни вериги. Обменни стъпала. Циклични процеси

Както анаболитните, така и катаболитните процеси са вериги от химични реакции - свързани една с друга, следващи една след друга. Тези вериги се наричат обменни пътища, а отделните реакции в обменните пътища - обменни стъпала. Стъпалата в обменните пътища се катализират от ензими. Обменните пътища са сложно преплетени помежду си. По тях се явяват много често разклонения, напр. пентозофосфатният път е се отклонява от гликолизата на ниво глюкозо-6-фосфат (виж глава "Обмяна на въглехидрати"). По този начин като се тръгне от едно вещество, може да се стигне до няколко крайни продукти. Често явление от една до друга точка в обменните пътища да се минава по няколко пътя, всеки водещ през различни междинни съединения. Най-често един от тези пътища е главен, а другите са второстепенни, или както се наричат още, алтернативни.

Друга характерна особеност на обмяната на веществата е наличието на кръгови процеси, или т. нар. обменни цикли. Те не са затворени процеси. Към тях се насочват и се увличат в кръговия процес вещества, а други съединения ги напускат. Смисълът на кръговите процеси е да въвличат субстрати и обменни реакции и след известна химична трансформация да ги изнасят извън цикличния процес. Цикличните процеси позволяват посредством малки количества междинни метаболити или кофактори да се преработва голямо количество вещество; те са израз на тенденцията в организмите към пестене на средства. Обикновено цикличните процеси са свързани едни с други ( например цитратен и уреен цикъл). Те се допират помежду си в една, а понякога в повече точки (притежават общи метаболити или общи стъпала). Такова устройство най-общо способства за прехвърлянето на едно съединение от цикъл в цикъл, свързано с последователната му преработка.

Движението на веществата по обменните пътища може да бъде и двупосочно - в анаболитно и катаболитно направление. Това е свързано с обратимостта на биохимичните реакции. Някои от обменните стъпала са обратими термодинамично, но се срещат и такива, които са силно ендергонични, т.е. необратими. Преодоляването им става чрез преминаване по околни, термодинамично възможни пътища, съчетани с процеси, които дават енергия.

По хода на обменните вериги се срещат междинни продукти, които явно заемат по-съществено място в обмяната на веществата. Това обикновено са такива съединения, от които се разклоняват или към които се концентрират няколко обменни пътя. Това са т.нар. възлови метаболити - напр. глюкозо-6-фосфат, пируват, глицераледихид-3-фосфат, ацетил-КоА и др.

1.6.4. Връзки и регулиране на обменните процеси във времето и пространството

Насочването на веществата към едни или други обменни пътища, интензивността, с която ще се използва даден обменен път в сравнение с други, и изобщо порядъкът в мрежата от обменни пътища зависят най-общо от два свързани помежду си фактора:
1) активността на ензимите, които катализират отделните стъпала в обменните вериги;
2) концентрацията на субстратите, които се доставят за отделните химични реакции.

Ако даден ензим, катализиращ определено стъпало от една обменна верига, понижи активността си, преминаването по веригата ще бъде затруднено (общата скорост по веригата от процеси се оопределя от най-бавното звено). Ако над потиснатато стъпало се намира разклонение, обменният процес ще се насочи към него. Ако обаче такова липсва или пък капацитетът му е нисък, ще се стигне до натрупване на субстрата на смутената ензимна реакция. Веществата, следващи потиснато стъпало, ще бъдат в намалени количества, ако към тях не води друг обменен път с достатъчно висок капацитет. Смущения във функцията на определени ензими са обикновено първопричина за смущения в обмяната, които по-нататък верижно се разпространяват и върху други звена от обмяната.

Постоянни и фино координирани колебания в активността на ензимите имат за резултат регулиране движението на вещества по обменните пътища в посоки и със скорост, полезна и необходима за правилното развитие на организма, съответстваща на неговите нужди.

Притокът на вещества към местата на обменните реакции в клетката или пък отстраняването на продуктите от реакциите от тези места са също фактори, които се отразяват върху протичането на обменните процеси. Скоростта на химичните реакции зависи и от концентрацията на реагиращите вещества. Процесите в организма протичат в открити (отворени) системи и това обстоятелство трябва да се има винаги предвид. При процесите не се установява по принцип равновесие, а е налице тенденция към стационарно състояние. Притокът и оттокът на метаболити към и от местата на реакциите зависят твърде много от активността на ензимите, катализиращи отделните стъпала на обменните пътища. Те зависят и от други фактори - напр. свойствата и активността на мембраните, през които преминават веществата, от концентрацията на веществата в околната среда и понякога от чисто физични причини, като напр. дифузия, осмоза и пр.

Обменните пътища са разположени не само във времето, но и в пространството. Абсурдно е да се счита, че биохимичните реакции се реализират при случайно срещане на субстратите със съответните им ензими при движението им в течната фаза на протоплазмата. Такава представа би направила невъзможен какъвто и да е порядък в обменните пътища и би свела до минимум възможностите за тяхното регулиране. Повечето от ензимите обаче са разположени върху мембранни образувания в клетката, и се намират следователно в твърда фаза. Това обстоятелство позволява пространственото им подреждане във вериги, по които субстратите се придвижват с последователна химическа обработка, подобно придвижване на машинни детайли по конвейрна лента. Доставянето на субстратите към съответните ензими или набори от ензими се направлява от дейността на многобройни вътреклетъчни мембрани. Субклетъчното и молекулното устройство на клетката се намират в неразривна връзка и единство с протичането на обменните процеси.

1.6.5. Типове обмяна

На фона на единството в биохимичните обменни процеси се проявява тяхното богато разнообразие. Сборът от всички особености в обменните процеси при даден организъм или даден тип клетки от един организъм обуславя т. нар. тип на обмяната. Типът на обмяната определя функционалните и морфологични особености на една клетка или един организъм. Според типа на обмяната организмите се делят на автотрофни и хетеротрофни.

Автотрофните организми използват като източници за своите биологични синтези неорганични съединения, които получават от околната среда, т.е. те се "хранят" с неорганични вещества (напр. СО2, азот, амоняк, сероводород и др.). Енергията се доставя от външни за организма източници. По-голямата част използват светлинна енергия, която въвличат в синтезни процеси - това са т. нар.фотосинтезиращи автотрофи. Такива са всички зелени растения. Друга група са хемосинтезиращите автотрофи, които са микроорганизми. Те използват енергия, получена при окисление на нискомолекулни неорганични вещества от околната среда (сероводород, сяра, нитрити и пр.).

Хетеротрофните организми се "хранят" с органична материя. Материали за биосинтезите при тях са органични съединения (напр. монозахариди, аминокиселини, мастни киселини). Единственият източник на енергия при тях е енергията, получена при разграждане на органични вещества.

Не съществува рязка граница между автотрофност и хетеротрофност. Между двата типа на обмяната се срещат всички възможни преходи. Дори и най-проявените хетеротрофни организми могат да използват за синтетични цели неорганични вещества - напр. включване на СО2, амоняк и вода. Обратно, строго автотрофните микроорганизми се развиват по-добре в присъствието на определени органични вещества, наречени растежни фактори.

Освен на автотрофни и хетеротрофни обменните процеси се разделят на други две големи групи - аеробни и анаеробни. Аеробен е този тип на обмяната, при който окислителните процеси се извършват за сметка на атмосферен кислород. Аеробните организми дишат - т.е. приемат непрекъснато кислород от атмосферата. Анаеробен е този тип на обмяната, при който окислителните процеси се извършват в отсъствие на кислород. Анаеробните организми не дишат. При тях отделеният при окислителните процеси водород се фиксира върху други вещества - акцептори, които се натрупват в организма или се изнасят от него. Повечето от организмите в биосферата са аероби.

Между аеробните и анаеробните организми не съществува рязка граница. И най-проявените аероби (напр. човекът) могат да извършват обменни процеси отчасти по анаеробен път. При това едни тъкани (напр. мускулна) са "по-склонни" към анаеробен начин на обмяна от други. Нервната тъкан не може да разгражда веществата анаеробно, т.е. тя е почти абсолютно аеробна. Има много организми, които са еднакво способни да водят и аеробен, и анаеробен начин на живот.

1.7. Примери за значение на познанията върху клетъчната структура и функции за медицината

Познаване структурата, функциите и метаболизма на клетките в нормален здрав организъм е необходима предпоставка за разбиране отклоненията, които са в основата на много болести. Нормалният метаболизъм включва вариации и адаптации при различни условия - бременност, лактация, гладуване, усилена физическа дейност. Патологични отклонения в метаболизма може да има при хранителна недостатъчност, при недостиг на ензими и нарушена секреция на хормони също се развиват заболявания. По-долу са подбрани три примера за начално запознаване с някои болести, за да се демонстрира значението на знанията върху клетъчната структура, функции и регулационни механизми за медицината. Не всичко на този начален етап от изучаването на биохимията може да бъде разбрано, но при повторно четене тези връзки с клиниката ще бъдат полезни за начинаещия медик.

1.7. 1. Митохондрийни болести

За първи път за митохондрийни болести се заговорва през 1962 год., когато за един тридесетгодишен пациент с обща слабост, изобилно потене, поднормено тегло въпреки изобилно поемане на храна и много висок базален метаболизъм (виж т. 19.2.13) е показано, че има дефект в механизма, който контролира използването на кислород в митохондриите (виж глава "Биоенергетика"). Оттогава са открити над 150 генетични дефекти, които са причина за дефекти в ензими, РНК, компоненти на дихателните вериги и мембранни транспортни системи в митохондриите [1-3]. Засегнатите гени могат да принадлежат както на митохондрийна, така и на ядрена ДНК. Първата болест, за която е установен дефект в митохондрийна ДНК , е наследствената оптична невропатия на Leber (внезапна слепота в ранна възраст). При много от заболяванията има увреждане на скелетните мускули и централната нервна система. Причина за увреждане на митохондрийната ДНК могат да бъдат свободни радикали (супероксид и други), които се образуват в митохондриите при метаболизма на аминокиселини и мастни киселини. Днес се приема, че митохондрийни увреждания може да допринасят в известна степен за възрастови дегенеративни болести като тези на Parkinson, на Alzheimer и кардиомиопатии. (В този курс на болестта на Паркинсон е посветена симулацията на клиничния случай "Димитър").

1.7. 2. Апоптоза

Апоптозата или програмираната клетъчна смърт е процес, при който клетки, които са изпълнили своята биологична функция, умират като с това допринасят полза за целия организъм. Апоптозата е важна през развитието на зародиша и на организма през целия му живот[4 - 6]. Различна е от некротичната смърт на клетката поради увреждане от радиация, недостиг на кислород (аноксия) и др. Протича в три фази: улавяне на инициационен сигнал, активиране на каскада от реакции, включващи белтъчни фактори, активиране на специфични ензими, разграждащи белтъци (протеази).

Специфични белтъци изпълняват ролята на инициационен сигнал, наричан сигнал на смъртта. Такъв например е факторът на туморната некроза (tumor necrosis factor или TNF). Сигналите на смъртта биват разпознавани от разположените в клетъчните мембрани високо специализирани рецептори, наречени рецептори на смъртта. Специфичността на сигналите и рецепторите определя кои клетки ще претърпят апоптоза. Рецепторите на смъртта са трансмембранни белтъци с вътреклетъчен домейн (участък), наречен домейн на смъртта. При свързване на рецептора с извънклетъчния сигнал, се активира домейнът на смъртта. Той се свързва със специфични белтъци и задвижва каскада от белтък-белтъчни взаимодействия. Активират се две протеази от семейството на каспазите - каспаза 8 и каспаза 9, които след това активират други каспази, а те активират високоспецифични клетъчни белтъци, което води до разрушаване на клетката. Каскадите се регулират от про- и анти-апоптични белтъци. Нарушения в баланса между тях може да доведе до преждевременна клетъчна смърт или до неконтролирано клетъчно делене.

Нарушения в пътищата на апоптоза са в основата на автоимунни, възпалителни, злокачествени и невродегенеративни и др. заболявания. Изясняване механизмите на апоптоза може да допринесе за лечението на тези заболявания.

1.7. 3. Подагра и лизозомни ензими

Подаграта е заболяване, при което се образува пикочна киселина в излишък. Клиничните признаци включват възпаление, болка, подуване и затопляне на някои стави, най-често на палеца на крака. Пикочната киселина се образува при катаболизма на пурини и нормално се изхвърля с урината. Разтворимостта на пикочната киселина е много ниска. При понишаване на концентрацията й в кръвта, тя започва да се отлага в ставите под форма на уратни иглести кристали. Кристалите се поемат от клетките на ставата чрез фагоцитоза и се натрупват в смилателни вакуоли, които се сливат с лизозоми [7 - 8]. Кристалите увреждат вакуолите, което води до освобождаване на лизозомни хидролитични ензими в цитозола. рН в лизозомите е около 5, а в цитозола над 7. Т.е. лизозомните ензими в цитозола са при неподходящо за тях рН, но въпреки това те все пак проявяват своята хидролитна активност. Това води до смилане (разграждане) на клетъчните компоненти, освобождаване на вещества от клетката и автолиза.

(За подагра виж също т. 4.2.10.1, 4.3.8.1, 4.4.6 и 9.5.1).

1.8. Насоки за самостоятелна работа

1. Използвайки уравнението на Henderson-Haselbalch


изчислете съотношението на HPO42- / H2PO4- ( pKa = 6,7) при рН 5,7; 6,7 и 8,7.

Отговори: 1/10; 1/1; 100/1.

Решение:

pH = pKa + log ([HPO42-] / [H2PO4-])

2. В здрави хора буферните системи в кръвта поддържат рН около 7,4. Под рН 7,35 състоянието се означава като ацидоза. При рН около 7,0 последиците са сериозни, може да настъпи дори смърт. Затова при ацидоза, предизвикана от промени в метаболизма (метаболитна ацидоза) е важно в кръвта да се следи както рН, така и концентрациите на НСО3- и на СО2. Нормалните стойности за здрав човек са дадени в таблицата по-долу. рКa за [НСО3- ] / [СО2] е 6,1.
Използвайки уравнението на Henderson-Haselbalch изчислете концентрацията на кръвния бикарбонат в пациент с метаболитна ацидоза (рН = 7,1 и [CO2] = 0,8 mM.

Отговор: 8 mM

Решение:

pH = pK + log ([НСО3- ] / [СО2])

1.9. Литература

1. Chalmers, R. M. and A. H. V. Schapira (1999) Clinical, biochemical and molecular genetic features of Leber's hereditary optic neuropathy. Biochim. Biophys. Acta 1410, 147.
2. Wallace. D. C. (1997) Mitohondrial DNA in aging and disease. Sci. Am. 280, 40.
3. Wallace. D. C. (1999) Mitohondrial diseases in man and mouse. Science 283, 1482.
4. Randhawa, B. A. S. (2000) Apoptosis, Mol. pathol. 53, 55.
5. Konopleva, M., S. Zhao, Z. Xie, H. Segall, et al. (1999) Apoptosis. Molecules and mechanisms. Adv. Exp. Med. Biol. 457, 217.
6. Wei, M. C., W. Zong, E. H. Cheng, T. Lindsen et al. (2001) Proapoptoxic BAX and BAK: A requisite gateway to mitochondrial disfunction and death. Science 292, 727.
7. Weissman, G. (1974) Crystals, lysosomes and gout. Adv. Intern Med. 19, 239.
8. Burt, H. M., P. H. Kalkman and D. Mauldin (1983) Membranolytic effects of crystalline monosodium urate monohydrate. J. Rheumatol. 10, 443.

 

Структура и функция на белтъци

Цели

Цели на преподавателя: да се разгледа значението, съставът и структурата на белтъците, да се свърже структурата на белтъците с тяхната функция и да се дадат примери за приложение на тези познания в клиничната практика.

След работа с този раздел студентите ще могат да демонстрират:

А. Знания
1) да дефинират понятието белтъци;
2) да изброят основните характеристики на мономерите, изграждащи белтъците;
3) да пишат общата формула на a-амино киселина и формулите на двадесетте L- a-аминокиселини, изграждащи белтъците;
4) да дефинират понятието пептидна връзка;
5) да дадат примери за нековалентни връзки и взаимодействия в белтъчните молекули;
6) да изброят особеностите на полипептидните вериги;

Б. Разбирания
1) да опишат особеностите на пептидната връзка и следствията от нейната резонансна стабилизация за структурната организация на белтъчните молекули;
2) да обяснят значението на нековалентните взаимодействия за възникване и поддържане на вторична, третична и четвъртична структура на белтъци;
3) да обяснят как се нагъват новосинтезирани полипептидни вериги;
4) да разбират и обяснят какво представлява денатурация и ренатурация;
5) да обяснят усложняващата се структура на белтъци от първична до четвъртична;
6) да обяснят принципите на методите за пречистване и разделяне на аминокиселини, пептиди и белтъци;

В. Умения
1) да класифицират двадесетте a-амино киселини в зависимост от химическата структура на радикалите и от полярността на радикалите;
2) по стойностите на pI да преценяват какви аминокиселинни остатъци (кисели или базични) преобладават в даден белтък;
3) да прилагат познанията върху a-амино киселини, за да представят първичната структура на белтъци като изписват полипептидна верига по различни начини: посредством структурни формули, с трибуквените и еднобуквените съкращения на аминокиселинните остатъци;
4) да визуализират посредством програмата RasMol вторичната, третичната и четвъртична структура на белтъци; да маркират и изследват различни групи и участъци в белтъчните молекули;
5) да разграничават и сравняват различни белтъци от гледна точка на връзката между структура и функции на белтъци, като се аргументират с конкретни примери;
6) да ползват, анализират и коментират лабораторни изследвания, необходими за поставяне на диагноза и изясняване механизма на някои заболявания, свързани с променени структура, функция, промени в количеството или недостатъчност на белтъци;
7) да прилагат знанията от този раздел за разбиране механизма и/или възможностите за терапия на някои заболявания;
8) да прилагат знанията от този раздел за решаване на клинични случаи (генетични заболявания напр. сърповидноклетъчна анемия);
9) да осъществяват търсене по биохимичен термин в рамките на сайта или извън сайта.

2.1.-2.1.1. Значение, състав и свойства на белтъци: Резюме

Белтъците са хетеробиополимери, които се получават при поликондензация на 20 т.н. "природни" a-аминокиселини, 19 от които са оптично-активни (всички от L-стеричен ред), една е оптически неактивна (Гли) и една е циклична иминокиселина (Про). Мономерите са свързани помежду си чрез пептидни връзки. Значението на белтъците произтича от разнообразните им и жизнено важни функции, които те изпълняват в организма (структуро-образуваща, каталитична, защитна, регулаторна, транспортна, двигателна, рецепторно-сигнална и складова).
  a-Въглеродният атом на аминокиселините, който носи амино- и карбоксилната група, е асиметричен с изключение при глицин. Според химическата структура на радикалите аминокиселините се делят на алифатни, с хидроксилна група, S-съдържащи, ароматни, кисели, киселинни амиди и базични. Според полярността на радикалите аминокиселините се делят на хидрофобни (неполярни) и хидрофилни (полярни). Разнообразните функционални групи в радикалите, наред с крайните амино- и карбоксилна групи, са от значение за структурата, свойствата и функциите на белтъчната молeкула.
 Част от полярните групи са йоногенни и могат да имат различен заряд при промяна на рН. При физиологично рН положително заредени са e-амино-групата на лизина, имидазоловия пръстен на хистидина, гуанидо-групата на аргинина и крайната амино-група. При физиологично рН отрицателно заредени са b-карбоксилната група на аспарагиновата киселина, g-карбоксилната група на глутаминовата киселина и крайната карбоксилна група. Наличието на базични и киселинни групи придава на белтъците амфотерни свойства и обуславя сумарния заряд на белтъчните молекули.

2.1.2. Определение и значение на белтъци

Белтъците са хетеробиополимери - високомолекулни съединения, изградени от мономери – 20 вида т.н. "природни" a-аминокисeлини, 19 от които са оптично-активни (всички от L-стеричен ред), една е оптически неактивна (Гли) и една е циклична иминокиселина (Про). Аминокиселините са свързани в полипептидни вериги чрез пептидни връзки. Молекулната маса на белтъците е от 10 000 до стотици хиляди.

Белтъците се делят на прости и сложни. Простите при хидролиза се разграждат само до аминокиселини, а сложните - до аминокиселини и небелтъчна съставка. Според формата си белтъците се делят на глобуларни (сферични - с компактно нагънати вериги, със съотношение на осите за дължина към ширина обикновено 3-4 към 1 до 10 към 1) и фибриларни (силно удължени молекули, в които дългата ос надвишава късата ос стотици пъти).

Молекулата на даден белтък съдържа една или повече полипептидни вериги. Всяка полипептидна верига съдържа различен брой от двадесетте вида мономери. При вариране броя и подреждането на мономерите, организмите могат да синтезират огромен брой различни вериги, респ. белтъци с разнообразни функции.

Значението на белтъците произтича от разнообразните и жизнено важни функции, които те изпълняват в организма:
 1) структурообразуваща функция: Белтъците имат много добре изразена способност заедно с други високомолекулни съединения да изграждат по-сложни комплекси, които образуват различни вътреклетъчни и междуклетъчни структури.
 2) каталитична функция: Част от белтъците са ензими, т.е. биокатализатори на определени химични реакции.
 3) защитна функция: Част от тях са антитела, които свързват и обезвреждат попаднали в организма чужди макромолекули. Други белтъци участват в кръвосъсирването и предотвратяват загуба на кръв при увреждане на кръвоносни съдове.
 4) регулаторна функция: Част от тях са хормони. Други, напр. ДНК-свързващи белтъци повлияват експресията на гените.
 5) транспортна функция: Белтъците свързват обратимо и пренасят по кръвен път различни вещества - например хемоглобинът пренася кислород и въглероден двуокис, трансферин пренася Fe; церулоплазминът - Cu, албуминът - висши мастни киселини, билирубин и др. Разположените в мембраните белтъци осигуряват специфичен активен пренос на вещества през мембраните.
 6) двигателна функция: Съкратителните белтъци актин и миозин са в основата на мускулното съкращение, а техни аналози - в "реснички" и "опашки" като двигателен апарат на едноклетъчни и др.
 7) рецепторна и сигнална функция: Част от белтъците са рецептори на хормони или други вещества. Рецепторите разпознават и предават хормоналния сигнал към вътрешността на клетката.
 8) "складова" функция: Във феритина се складират запаси от желязо, в миоглобина - кислород и др. Освен това те са източник на биологично активни вещества, които се образуват при дисимилацията им. Те могат да бъдат и източник на енергия - в крайни ситуации след изчерпване на другите енергетични източници (въглехидрати и мазнини).

2.1.3. Химическа структура на аминокиселините, изграждащи белтъците

Общата формула на a-аминокиселините е дадена на фиг. 2-1. Всички аминокиселини имат карбоксилна група и аминогрупа при общ a-въглероден атом (при пролин вместо амино- има циклична имино-група). Тези именно групи участват в образуване на ковалентните пептидни връзки и изграждат скелета на полипептидните вериги. При неутрални рН стойности свободните L-a-аминокиселини в разтвор са преобладаващо под форма на цвитерйон, т.е. заредена е както карбоксилната, така и амино-групата.
a-Въглеродният атом в аминокиселините е асиметричен, с изключение при глицин, в който R = H, т.е. a-въглеродният атом няма четири различни заместители.

Фиг. 2-1. Абсолютна конфигурация на L-аминокиселина (вляво) и D-аминокиселина (вдясно). При физиологично рН (около 7) карбоксилната и амино-групата са заредени.

 Аминокиселините, изграждащи белтъците, в зависимост от химическата структура на радикалите се разпределят в подгрупи, както следва по-долу. Техните формули и съкращения (трибуквени- на български, и еднобуквени- на английски) може да видите, като щракнете върху названието на аминокиселината. Ново прозорче със следващата аминокиселина ще се отвори, само ако затворите предишното. Големината на прозорчето може да се променя.
1) Алифатни аминокиселини: глициналанинвалинлевцин, изолевцин;
2) Хидрокси-аминокиселини: серинтреонин;
3) S-съдържащи аминокиселини: цистеинметионин;
4) Ароматни аминокиселини: фенилаланин, тирозин, триптофан;
5) Циклична имино-киселина: пролин;
6) С допълнителна базична група: лизинаргинин,   хистидин
7) С допълнителна карбоксилна група и техните амиди: аспарагинова киселина, глутаминова киселинааспарагинглутамин.

За удобство всички аминокиселини са дадени и в една обща фигура  по-долу.

 

 Тези двадесет аминокиселини, едни и същи за всички организми, се наричат кодирани, защото за тях има специфични кодони в генома. За всяка от тях има поне един специфичен кодон в ДНК. Чрез допълнителни химически следсинтетични модификации някои от тези аминокиселини, вече включени в полипептидна верига, се превръщат в производни аминокиселини: напр. цистин (при окисление на два цистеинови остатъка), хидроксипролин и хидроксилизин в колаген, десмозин в еластин,  g-карбоксилглутамат в протромбин и др., т. е. те са резултат от следтранслационна модификация.

2.1.4. Относителна хидрофобност на аминокиселинните радикали

Въз основа на относителната хидрофилност или хидрофобност на радикалите (склонността да се свързват или не с вода), аминокиселините се разделят най-общо на хидрофилни (Арг, Хис, Лиз, Асп, Глу, Асн, Глн, Цис, Сер, Тре, Гли) и на хидрофобни (Ала, Вал, Лев, Иле, Мет, Про, Фал, Тир, Три) [1]. Поради наличието на различни групи, някои от аминокиселините са амбивалентни, т. е. в зависимост от микрообкръжението променят отнасянията си от хидрофобни на хидрофилни.

Относителната хидрофобност се измерва като енергия на пренос (kcal/mol) на аминокиселината от неполярен разтворител във вода. Като мярка за хидрофобността се използва и т.н. хидропатичен индекс (табл. 2-1) [2]. Отрицателните, респ. положителните стойности на тази величина показват, че аминокиселинният остатък в даден белтък може да се намира във водно, респ. хидрофобно обкръжение.

Като цяло полярността на радикалите варира широко, от силно неполярни (хидрофобни, напр. триптофан, фенилаланин, изолевцин) до силно полярни (хидрофилни, напр. лизин, аргинин). Но във всяка група също има различни степени на полярност поради присъствието на различни функционални групи. Например и трите ароматни аминокиселини фенилаланин, тирозин и триптофан могат да участват в хидрофобни взаимодействия, но тирозинът заради фенолната група и триптофанът заради N-атом в индоловия пръстен са по-полярни от фенилаланин.

Табл. 2-1. Стойности за хидропатичните индекси на
аминокиселинните остатъци*.
Амино-
киселина
Хидропатичен
индекс
Амино-
киселина
Хидропатичен
индекс
Аланин 1.8 Пролин - 1.6
Валин 4.2 Серин - 0.8
Левцин 3.8 Треонин - 0.7
Изолевцин 4.5 Аспарагин - 3.5
Цистеин 2.5 Глутамин - 3.5
Метионин 1.9 Аспартат - 3.5
Фенилаланин 2.8 Глутамат - 3.5
Глицин - 0.4 Хистидин - 3.2
Триптофан - 0.9 Лизин - 3.9
Тирозин - 1.3 Аргинин - 4.5

* По данни на [2].

Замяната на полярен остатък с хидрофобен или обратно, се нарича неконсервативна замяна. Такава замяна се наблюдава напр. на шеста позиция в b-веригите на патологичния хемоглобин S, който съдържа валин вместо глутамат. Обратно, в случаите, когато един остатък се заменя с друг, който има близка относителна хидрофобност, напр. валин с левцин, казваме, че замяната е консервативна.

2.1.5. Значение на радикалите за структурата, свойствата и функциите

Свойствата на аминокиселинните радикали, изграждащи белтъците, са основни структурни детерминанти, т.е. те определят структурата, свойствата и функциите на белтъците. Хидрофобните остатъци участват в хидрофобни, а полярните- в електростатични взаимодействия, които са от значение за оформяне на уникалната структура на даден белтък. За това допринасят и цистеиновите остатъци, които образуват помежду си дисулфидни връзки. Глицинът, най-малката и с най-проста структура аминокиселина, се вмества в участъци, недостъпни за по-големи остатъци. Тези участъци често са място, където полипептидната верига се огъва.

При физиологично рН положително заредените, както и отрицателно заредените групи, реагират като слаби киселини и слаби основи и придават на белтъците амфотерни свойства. Тези групи участват в пренос на заряди в ензимната катализа или в дихателната верига. Хистидинът със своето имидазолово ядро допринася за буферните свойства на белтъците при физиологично рН.

Ароматните аминокиселини поглъщат светлина в ултравиолетовата област (250-290 nm). От трите ароматни най-голям принос за екстинкцията на белтъци при 280 nm има триптофанът. Затова концентрацията на безцветни белтъци, които съдържат ароматни аминокиселини може да се определя чрез директно измерване на екстинкцията при 280 nm, без да е необходимо оцветяването им.

Карбоксилни и амино-групи в ензимни белтъци често се използват за свързване на различни субстрати. Алкохолната група на серина и сулфхидрилната група на цистеина участват в активните центрове на различни ензими. Цистеиновите остатъци могат да образуват помежду си дисулфидни връзки, които се срещат в доста белтъци и допринасят за стабилизиране на структурата им. Серинът и треонинът (с алкохолна група) и тирозинът (с фенолна група) могат да бъдат обратимо ковалентно модифицирани чрез фосфорилиране-дефосфорилиране и това има голямо значение за регулиране на ензимната активност.

2.1.6. Зарядови свойства на аминокиселини

В свободните и във включените в белтъци аминокиселини има няколко групи, които се отнасят като слаби киселини: -СООН група – в С-края и в аспарагинова и глутаминова киселина; -NH3+ - в N-края и в лизин; и други групи в хистидин, аргинин, цистеин и тирозин. (фиг. 2-3). В разтвор тези протонирани групи са в равновесие със съответните спрегнати бази.

Фиг. 2-3 Дисоциация на аминокиселинните радикали.
С увеличение на рН зарядът на радикалите се мени. Под рКa преобладава спрегнатата киселина, а над рКa преобладава спрегнатата база.

Протонната дисоциация на киселините се характеризира с константата на дисоциация Кa (индексът а идва от английското название на киселина - acid), представяна обикновено като рКa (рКa= - log Ka). Тази константа отразява относителната сила (реципрочен афинитет към протона) на дадена група като слаба киселина. Съгласно уравнението на Henderson-Hasselbalch (ур. 2-1) рКa на дадена група е това рН, при което са дисоциирали 50 % от групата, т.е. концентрацията на спрегнатата база е равна на тази на спрегнатата киселина (тъй като log1=0):

В зависимост от обкръжението, в което се намират групите, стойностите на рКa  могат да варират в определен интервал, както личи от фиг. 2-3. Крайните карбоксилна и амино-групи имат по-ниски стойности за рКa  отколкото, ако са във вътрешността на веригата.

В разтвор свободните аминокиселини съществуват в зависимост от рН в различни йонни форми. При моноаминокарбоксиловата аминокиселина валин рКa за a-COOH група е 2.2 и за e-NH2 -групата е 9.7. При рН < 2.2 валинът има заредена амино-група (заряд +1). При физиологично рН около 7 сумарният заряд е 0 (заредени са и амино- и карбоксилната групи). Тази форма се нарича цвитерйон. При нея броят на положителните заряди е равен на броя на отрицателните заряди. При рН > 9.7 заредена е само карбоксилната група. Изцяло незаредена форма не съществува при никое рН. Поради наличието на допълнителна група йонните форми на лизин и аспартат са четири при pH около 7.

Това рН, при което аминокиселината е електрически неутрална и се намира в цвитерйонна форма, се нарича изоелектрично рН или изоелектрична точка (рI). При моноамино-монокарбоксиловите киселини pI е средно аритметично от рКa на карбоксилната и амино-група, напр. рІвалин = (2.2+9.7)/2 = 5.95. При аминокиселини с допълнителни функционални групи pI приблизително е средно аритметично от рКa на групите с еднакъв заряд. Напр. при лизин (с допълнителна амино-група) рКa за a-COOH група е 2.2, за a-амино групата е 9.0 и за e-NH2 -групата е 10.5 и рIлизин = (9.0+10.5) / 2 = 9.75.

2.1.7. Зарядови свойства на белтъци

В белтъците a-амино и a-карбоксилните групи са ангажирани в пептидните връзки. От значение за сумарния заряд и за буферните свойства на белтъците са само крайните групи и тези от страничните радикали (фиг. 2-3). Сумарният заряд на белтъчната молекула зависи от аминокиселинния състав и от рН на средата. В киселата област е потисната дисоциацията на киселите групи и зарядът поради наличие на положително заредени групи е положителен и твърде висок (фиг. 2-4). С увеличение на рН зарядът намалява, минава през нула и започва да нараства в отрицателна посока. В алкалната област дисоциацията на базичните групи е потисната и поради наличието на отрицателно заредени карбоксилни групи сумарният заряд е отрицателен.

 Фиг. 2-4. Зависимост на сумарния заряд Z на белтъчната молекула от pH. По Т.Николов [3].

 Пресечната точка на кривата с абсцисата е рI (това рН, при което сумарният заряд е нула).

Изчисляването на рI за белтъци чрез уравнението на Henderson-Hasselbalch е неточно. Предпочита се експериментално определяне на рI - като рН, при което белтъкът, имайки сумарен заряд нула (равен брой положителни и отрицателни заряди), не се движи в електрично поле. Изоелектричната точка за даден белтък зависи от природата на буфера, от йонната сила на разтвора, от конформацията на белтъка и др. Нейната стойност дава, макар и приблизителна, представа за аминокиселинния състав. Белтъци, които съдържат повече аргинин, лизин и хистидин, имат по-високи рI и се наричат алкални белтъци, например за цитохром с  рI=10.0. Обратно, белтъци, в които преобладават глутаминова и аспарагинова киселини, имат по-ниски рI (кисели белтъци, напр. пепсин с рI ~ 1, серумен албумин  (рI = 5.9 и др.).

Белтъците действат като буферни системи в широк рН диапазон, определян от рК на големия брой различни дисоцииращи групи в радикалите им. Буферният капацитет на всяка група е най-силен при рН около рК на групата. С най-голямо физиологично значение за буферните свойства на белтъците е хистидин, тъй като неговият имидазолов пръстен има рКa между 6 и 7, т.е. най-близо до физиологични рН.

2.2.-2.2.1. Структура на белтъци: Резюме

Белтъците имат четири нива на организация: първична, вторична, третична и четвъртична структури. Първичната структура е последователността на аминокиселинните остатъци и локализацията на дисулфидни връзки в полипептидните вериги. Определя се от ковалентни пептидни връзки между остатъците. Тя е генетично детерминирана и определя по-висшите нива на организация.

Вторичната структура представлява локално нагъване на част от полипептидната верига в a-спирални или
b-верижни участъци, стабилизирани главно от водородни връзки между близко разположени пептидни групи.

Третичната структура се отнася до пространствените взаимоотношения между всички аминокиселинни остатъци във веригата, т.е до цялостното пространствено нагъване на полипептидната верига и нейното фиксиране чрез нековалентни взаимодействия (хидрофобни, електростатични или други) между отдалечени по веригата аминокиселинни остатъци. Дисулфидните връзки (в белтъци, съдържащи цистеинови остатъци) също допринасят за стабилизиране на третичната структура.

Четвъртичната структура се определя от пространственото разположение на две или повече полипептидни вериги (наричани субединици), обединени в едно цяло в структурно и функционално отношение. Тя, както вторичната и третичната структури, зависи от нековалентни взаимодействия.

Денатурацията е процес, при който се нарушават нековалентни взаимодействия, засягат се по-висшите нива на организация без първичната структура и се губи биологичната активност.

Нагъването на полипептидните вериги в пространството се улеснява от специални ензими (пролил рацемаза и протеин дисулфид изомераза) и специални белтъци, наречени шаперони. Шапероните при физиологични условия предотвратяват неправилното нагъване и "нежеланите" взаимодействия между аминокиселинните радикали в новосинтезиращите се полипептидни вериги.

2.2.2. Първична структура на белтъчните молекули

За да бъде разбрана по-лесно сложната пространствена организация на белтъчните молекули, съдържащи хиляди атоми, тяхната структура се разглежда на четири равнища: първично, вторично и третично и четвъртично равнище. Съответно се използват термините първична, вторична, третична и четвъртична структура.

Първичната структура представлява подреждането на аминокиселините в полипептидните вериги на молекулата, т.е аминокиселинната последователност. При наличие на дисулфидни връзки (вътрешноверижни или междуверижни) се указва тяхната локализация, т.е. посочва се между кои цистеинови остатъци е образувана дадена дисулфидна връзка. Първичната структура зависи само от ковалентни пептидни връзки. Тя детерминира останалите нива на организация. Тя е свързващото звено между генетичната информация и физиологичната функция. На първично равнище белтъчната молекула може да бъде представена опростено като линеен запис чрез последователно изписване с обикновените структурни формули на аминокиселинните остатъци в посока от N към С края, както е показано на фиг. 2-5.

 Фиг. 2-5. Част от една полипептидна верига, изписана с обикновените структурни формули.

Изписването на първичната структура по този начин отнема време и място. Броят на остатъците в белтъците е различен (от стотина в цитохром с до няколко хиляди в други белтъци. Напр. във веригата на белтъка апо-В100 има 4536 остатъка. Тъй като гръбнакът на всички вериги е еднакъв поради повтаряне на групировката >СН-СО-NH-, използува се и съкратен начин за представяне на първичната структура чрез трибуквените или еднобуквените съкращения на аминокиселините.  На фиг. 2-6 е представена молекулата на хормона инсулин от човек, използван за лечение на диабет. Инсулинът се състои от две вериги: верига А (21 остатъка) и верига В (30 остатъка). Две междуверижни дисулфидни връзки свързват тези вериги, а във верига А има вътрешноверижна дисулфидна връзка.



Фиг. 2-6. Съкратено представяне на първичната структура на двете вериги (А и В) на човешки инсулин в посока от N- към С-края.
 Оцветени са остатъците А8, А9, А10 от верига А и В30 от верига В, които в различни животински видове се различават от тези в човек (вж т. 2.5.4). Данните са по [5] и [4].
I - чрез трибуквени съкращения; II - чрез еднобуквени съкращения.

Въпреки ниската молекулна маса на инсулин (5 734 KDa), той се причислява към белтъците, тъй като се синтезира като неактивен предшественик препроинсулин (11 500 KDa). От него след протеолитично отцепване на пептид от N-края, наричан сигнален (вж гл.14), се получава проинсулин (9 000 KDa) (фиг. 2-7). От проинсулин след отделяне на пептид С и два дипептида се оформят веригите А и В на мономера инсулин.


Фиг. 2-7. Схематично представяне на полипептидната верига на проинсулин с 86 аминокиселинни остатъци. От тази обща верига след хидролитно отделяне на пептид С (в червено) и два дипептида се получават двете вериги на инсулин: верига А с 21 остатъци (в черно) и верига В с 30 остатъци (в синьо).

Както личи от фиг. 2-5 и фиг. 2-6, полипептидните вериги, изграждащи белтъците, се характеризират със следните особености:
 1) Веригите имат два различни края: азотен или N-край (свободна амино-група) и въглероден или С-край (свободна карбоксилна група). Тези групи при рН 7 са в йонизирано състояние.
 2) Няма циклизация на веригата - краищата са свободни.
 3) Няма разклонения, защото в образуване на пептидната връзка участвуват само a -амино и a -карбоксилни групи.
 4) Веригите имат еднакъв скелет, тъй като се повтаря една и съща групировка >CH-CO-NH-.
 5) разнообразието на природните полипептиди и белтъци е следствие от различия в аминокиселинната последователност.

Названията на аминокиселинните остатъци в пептидната верига добиват окончание -ил, напр. пептид, съдържащ глицин, аланин, лизин и валин ще се чете като глицил-аланил-лизил-валин. Последният аминокиселинен остатък в С-края не променя названието си.

Огромен брой белтъци вече имат изяснена първична структура. Данните се съхраняват в електронен вид в специални масиви от база данни, напр. Protein Data Bank (PDB) или European Molecular Biology Laboratory Data Library (EMBL), които са достъпни чрез Интернет. Eлектронната търсачка PubMed (The National Library of Medicine's Search Service) [6] има достъп до повече от 11 млн заглавия в Medline, PreMedline и други база-данни с връзки към изходните свързани с Интернет списания.

При опростеното представяне на белтъчната молекула в една равнина (фиг. 2-5 и 2-6), не се вземат предвид нито особеностите на пептидната връзка, нито другите възможни взаимодействия. Но в действителност те съществуват и обуславят по-висшите структури.

2.2.3. Връзки в белтъците

Пептидната връзка е ковалентна връзка, която се получава при кондензация на -СООН група от една аминокиселина и амино-група от друга аминокиселина.

Резонансната стабилизация на пептидната връзка е представена на фиг. 2-8-I. Полудвойните връзки в пептидната група обуславят равнина на спрежение. Четирите атоми С, O, N, H, както съседните a-C атоми, лежат в тази равнина и поради това свободно въртене около осите на полудвойните връзки не е позволено. Свободно въртене под определен ъгъл е позволено само около съседните на пептидната група прости връзки N-Сa (ъгъл f) и Сa-С (ъгъл y). Тези ъгли f (phi) и y (psi) са въведени от Рамачандран. Радикалите, прикрепени към a-С атоми, са в предпочитана транс-позиция спрямо равнината на пептидната връзка. Друго важно следствие от мезомерията на пептидната връзка е възможността да се образуват водородни връзки между близко разположени пептидни групи.

Фиг. 2-8-I. Резонансна стабилизация на пептидната връзка.

Наред с ковалентните пептидни и дисулфидни връзки, в белтъците има и голям брой други нековалентни взаимодействия, които, макар и значително по-слаби, са важни за структурата, свойствата и биологичната активност на белтъците (табл. 2-2).

Табл. 2-2. Видове връзки и взаимодействия в белтъчните молекули*
Връзки или взаимодействия Енергия на връзката
(kJ/mol)
Ковалентни пептидни връзки около 400
Ковалентни дисулфидни връзки около 214
Водородни връзки 4.2 - 25
Хидрофобни взаимодействия < 4.2
Йонни връзки < 21

    *Данните са по Т. Николов [3].

Водородни връзки възникват, когато Н атом е между два по-електроотрицателни атоми, с единия от които е ковалентно свързан. Напр. H, свързан към N от една пептидна група, се привлича от О на друга пептидна група. Водородните връзки са по-слаби от ковалентните връзки, но поради големия им брой между близко разположени пептидни групи, те имат значение за стабилизиране на вторичната структура. Водородни връзки има и между повърхностно разположени полярни радикали и водни молекули.

Хидрофобни взаимодействия има между неполярни радикали, които в разтворимите глобуларни белтъци се разполагат във вътрешността на молекулата. При белтъци, вградени в хидрофобни мембрани, е налице повърхностно разположение на неполярни остатъци, които участват в хидрофобни взаимодействия с мембранните липиди.

Електростатични взаимодействия има между заредени групи от радикалите (привличане и отблъскване). Тези заредени групи са обикновено по повърхността на белтъчната молекула, но има случаи, когато такива групи с важна функция са в жлеб, разположен във вътрешността на молекулата.

Ван дер Ваалсовите взаимодействия на привличане и отблъскване са много слаби и действат на къси разстояния между временно индуцирани диполи. Оптималното контактно разстояние между два атома е сумата от техните Ван дер Ваалсови радиуси. При него привличането е максимално, а отблъскването минимално.

2.2.4. Вторична структура

Теоретично ъглите на въртене f (около оста N-Сa ) и y (около оста Сa-С) (фиг. 2-8-I) могат да заемат стойности от -180о до +180о, но на практика много от тези стойности са забранени поради пространствено пречене между радикалите. Т.е. само теоретично са възможни безброй конформации на полипептидната верига при различно завъртане на плоскостите на пептидните групи една спрямо друга. Поради възникването на голям брой водородни връзки между близко разположени пептидни групи и поради пространствено пречене между радикалите, тези ъгли f и y не могат да имат произволно значение и веригата в отделни участъци се огъва по определен начин - т.е. възниква вторична структура.

Фиг. 2-8. Особености на пептидната връзка и видове вторична структура.
 I - Резонансна стабилизация на пептидната връзка. При определени стойности на f (около оста N-Сa) и y (около оста Сa-С) възниква a-спирала (II) или b-структура (III) - вж също табл. 2-3.

Вторичната структура се отнася до локалното нагъване на части от полипептидната верига под форма на a-спирала (фиг. 2-8-II), b-структура (фиг. 2-8-III) или друг тип спирала с определени параметри (табл. 2-3). Тези параметри са: ъгли на Рамачандран f и y, брой остатъци на един оборот на спиралата (n), разстояние между a-C атоми на съседни остатъци (d) и ход на спиралата (p = n x d). Термодинамично най-стабилни са a-спиралата и b-структурата. Различните видове структура се стабилизират от водородни връзки между близко разположени пептидни групи.

При a-спиралата водородните връзки са вътрешноверижни и успоредни на оста на спиралата през 4 остатъка (между CО групата на остатък m и NН групата от остатък m+4), както личи от модела на Полинг (фиг. 2-9) и различните компютърни изображения на a-спиралата (фиг. 2-10). a-Спиралата е възможно най-компактната форма на полипептидната верига (n = 3.6, докато за b-веригата n = 2.0 - вж табл. 2-3).

Табл. 2-3. Видове вторични структури с характерните им параметри.
Структура n p (nm) f (о) y (о)
a-Спирала с десен ход 3.6 0.54 - 57 - 47
b-Верига в паралелен b-лист 2.0 6.4 - 119 + 113
b-Верига в антипаралелен b-лист 2.0 6.8 - 139 + 135
Спирала от полипролинов тип II 3.0 9.4 - 78 + 149

     n - брой аминокиселинни остатъци за един оборот на веригата; p -  ход на спиралата; (p= n x d), където d - разстояние между a-C атоми на съседни остатъци; f и y - ъгли на Рамачандран.


Фиг. 2-9. Теоретичен модел на Полинг за дясно-завита a-спирала.
 Във всеки оборот на спиралата участват 3.6 аминокиселинни остатъка, т.е n = 3.6;
d - разстояние между a-C атоми на съседни остатъци; d = 0.15 nm; p - ход на спиралата; p = n x d = 0.54 nm.



Фиг. 2-10. Различни изображения на a-спирален участък чрез компютърната програма Raswin [7]. Фрагментът съдържа в посока от N към С-края (отгоре надолу) следните 13 остатъци: Ала, Гли, Сер, Тре, Лев, Иле, Вал, Асн, Глн, Арг, Хис, Ала, Лиз.[8]
 1 - модел тип "гръбнак" (backbone); 2 - модел тип "жица" (wireframe); 3 - модел тип "прозрачна панделка" (strands); 4 - модел тип "плътна панделка" (ribbon); 5 - модел тип "пръчки" (sticks);6 - модел тип "топки и пръчки" (balls and sticks); 7 - пълен пространствен модел" (full space).
 С редуващ се цвят са откроени отделните аминокиселинни остатъци. Водородните връзки (вътрешноверижни и успоредни на оста на спиралата) са представени с пунктири.

b-Веригата е сравнително най-опънатата форма на полипептидната верига (n=2 - вж табл. 2-3). Водородни връзки се образуват между близко разположени пептидни групи от различни вериги или между различни участъци на една верига (фиг. 2-8-III и фиг. 2-11). Водородните връзки са приблизително перпендикулярни на осите на веригите. Сближените вериги образуват леко зигзаговидно нагъната повърхност (като мех на хармоника), която може да се идеализира като равнина. Страничните остатъци (R) са разположени почти перпендикулярно на мислената равнина, в която лежи "хармониката" и са алтернативно повтарящи се от двете й страни.

Възникващата система от паралелни (еднопосочни) или антипаралелни (разнопосочни) вериги се означава като мотив от типа b-лист. Преобладават антипаралелните b-листове (фиг. 2-11). Броят на b-верижните участъци в b-листа може да варира от 2 до 15. Вериги с обща формула (- Гли - Х) позволяват да бъдат плътно опаковани и имат висока механична стабилност - напр. като при фиброин от коприна.

Мотивът е повтаряща се комбинация от елементи на вторичната структура, напр. abab, bb (b-лист), ab (гривна), гръцки ключ и др.
 a-Спиралните и b-верижните участъци съставляват около 50 % от цялата верига. Останалите участъци в местата на огъване се означават като бримки и са не по-малко важни за биологичната функция на даден белтък. Бримките не трябва да се бъркат с термина "случайно нагъната верига", използван за денатурирани вериги.



Фиг. 2-11. Различни начини на представяне на структура от типа b-лист чрез програмата Raswin [7].
Част от полипептидна верига съдържа в посока от N- към С-края следните остатъци: Глу, Вал, Лиз, Лев, Глу, Глу, Сер, Гли, Гли, Гли, Лев, Вал, Глн, Про, Гли, Гли, Сер, Мет, Лиз, Лев, Сер, Цис, Ала, Тре, Сер, Гли, Фал, Тре, Фал, Сер.[9]

N-краят е в лeвия горен край и е в син цвят. Водородните връзки (представени с пунктири) между остатъците в двата антипаралелни b-участъци стабилизират b-структурата.
 1 - Всички остатъци са представени с модел тип "пръчки и топки"; 2- b-верижните участъци са представени с модел тип "панделка"; а остатъците в местата на огъване - с модел "пръчки и топки". Атомните координати са по [10].

2.2.5. Третична структура на белтъчните молекули

Далечните нековалентни взаимодействия между аминокиселинните остатъци определят по-висшата третична структура на белтъчната молекула - т. е. начинът на пространствено нагъване на цялата верига, която може да съдържа a-спирални и/или b-структурни участъци. На фиг. 2-12 са дадени примери за нековалентни взаимодействия между отдалечени радикали. Те могат да бъдат:

1) хидрофобни взаимодействия - между неполярни аминокиселинни остатъци;

2) полярни взаимодействия между полярни остатъци:
  а) йонни (привличане между противоположно заредени групи) или отблъскване между едноименно заредени групи);
  б) йон-диполни - между заредена група и полярна, но недисоциираща група;
  в) водородни връзки между радикали.

В белтъците, които съдържат цистеинови остатъци или пролин, има още две причини, които обуславят и поддържат третичната структура:
 1) дисулфидни връзки - вътрешноверижни или междуверижни (вж. фиг. 2-6);
 2) включването на пролин може да огъне веригата, тъй като целият петатомен пръстен се включва във веригата (вж фиг. 2-5).

Фиг. 2-12. Нековалентни взаимодействия между отдалечени по веригата радикали.
 1 - хидрофобни взаимодействия; 2 - електростатични взаимодействия; 3 - водородни връзки.
 

На фиг. 2-13 е показана третична структура на различни белтъци, но в рамките на отделните фрагменти личи добре и локалната вторична структура.


 Фиг. 2-13. Третична структура на белтъци. .
 1 - a1-субединица на хемоглобин, съдържаща хем [9],  2 - бактериородопсин [11]; 3 - фрагмент от верига Н на имуноглобулин G [12]; 4 - химотрипсин [13]; 5 - алдолаза [14]; 6 - химотрипсиноген [15].

Фигурите са приготвени с програмата Raswin [7], ползвайки данните за съответните атомни координати от Protein Data Bank [10].

На фиг. 2-13-1 е дадена третичната структура на a1-субединица на хемоглобин [9 ]. Около 75 % от нея се състои от 8 a-спирални участъка, съединени с къси неструктурирани участъци. Освен a-спиралните участъци, представен е и хемът (небелтъчна лиганда, необходима за свързване на кислород). Тези осем участъци се означават с латинските букви от A до H, а остатъците във всеки от тях се означават с съответната буква на участъка и номера, който те заемат в него. Например F8 и F7 са двата хистидинови остатъци, разположени от двете страни на хема. Останалата част от веригата е под форма на къси участъци, свързващи спиралните участъци. Освен водно-разтворими белтъци като хемоглобин, и някои мембранно разположени белтъци съдържат a-спирални участъци. Такъв е бактериородопсинът (фиг. 2-13-2). Седемте a-спирални участъци са в по-тъмен цвят. С пунктир са представени водородните връзки, стабилизиращи спиралните участъци. С по-светъл цвят и чрез пълния пространствен модел е представена небелтъчната лиганда 11-цис-ретинал.

Други белтъци съдържат предимно b-структурни участъци, най-често антипаралелни, съединени с къси участъци. Такива има напр. в Cu, Zn-супероксид дисмутаза, конканавалин А, в тежките вериги на имуноглобулини (фиг. 2-13-3), в химотрипсин (фиг. 2-13-4) и много други. На фиг. 2-13-3 с пунктир са дадени водородните връзки между антипаралелни b-верижни участъци, групирани в b-лист.

Някои белтъци съдържат както a-спирални, така и b-структурни участъци. Такива са напр. триозофосфат изомераза, пируват киназа, лактат дехидрогеназа, химотрипсиноген (фиг. 2-13-5), алдолаза (фиг. 2-13-6) и много други.

Третичната структура е високоспецифична - полипептидната верига се нагъва по строго определен начин - в резултат на което възниква уникална пространствена (3D) структура. Всяко изменение на тази структура, дори минимално, се отразява на биологичните функции и свойства. Следователно, на ниво третична структура белтъците имат определена форма и големина в пространството.

Дотук разгледаните белтъци спадат към глобуларните белтъци, тъй като молекулате им имат сферична или леко удължена форма (съотношението на дългата към късата ос е под 10:1). Във вътрешността на глобулата се ориентират хидрофобните остатъци, а по повърхността – хидрофилните остатъци. Около последните се ориентират водни диполи (хидратационна обвивка). По повърхността, обаче, може да има и зони от хидрофобни аминокиселини, често от значение за активността на белтъка. Глобуларните белтъци имат обикновено каталитична или регулаторна роля. Обикновено по повърхността или близо до нея при каталитичните белтъци се разполагат активният център и други регулаторни центрове.

Белтъци, при които дългата ос е много по-дълга от късата ос, се наричат фибриларни. Те имат структуро-образуваща функция. Изграждат разнообразни структури – кости, кожа, сухожилия. Те са неразтворими във вода. Примери за фибриларни белтъци са еластин (изграждащ сухожилия), фибрин (изграждащ кръвния съсирек), кератин, колаген и др. Кератинът участва в изграждане на епидермиса и роговите образувания - косми, нокти, рога и копита). При кератина три a-спирализирани вериги с десен ход се усукват в суперспирала с ляв ход (фибрила). Между веригите възникват напречни киселинно-амидни връзки между -COOH на Глу и e-амино-групата на Лиз. Такива връзки са характерни за кератини в рогови образувания, но са по-редки в кератин от епидермис. Колаген (главният компонент на съединителната тъкан, наричана още екстрацелуларен матрикс), ще бъде разгледан в т. 2.3.4.

2.2.6. Четвъртична структура

Четвъртичната структура се определя от пространственото разположение на две или повече полипептидни вериги (наричани субединици или протомери), образуващи общ комплекс. Всяка субединица има своя първична, вторична и третична структура. Първичната структура на субединиците може да бъде еднаква, или различна и съответно белтъците биват хомо- или хетеро-олигомери. Субединиците са свързани чрез нековалентни взаимодействия (водородни връзки, хидрофобни и електростатични взаимодействия). Едни от субединиците изпълняват каталитична функция, а други разпознавателна и регулаторна функции. Промяната в пространственото разположение на субединиците променя свойствата на молекулата. Затова белтъците с четвъртична структура имат важна роля за регулацията на вътреклетъчните процеси.

За белтъци, изградени от няколко полипептидни вериги, които са свързани чрез ковалентни дисулфидни връзки (напр. имуноглобулини) или за белтъци, съдържащи само една полипептидна верига, не може да се говори, че имат четвъртична структура. Ако все пак между субединиците на даден белтък са налице ковалентни връзки, то те са резултат от следсинтетична модификация.

Белтък с четвъртична структура е хемоглобин (фиг. 2-14). Той е изграден от четири субединици - две a- и две b-вериги, всяка с 141 и 146 остатъка съответно. Означенията a- и b- тук се отнасят до различия в първичната структура. Всяка от субединиците е глобуларен белтък и в съвкупност комплексът от 4 субединици също има форма на глобула. Всяка от веригите носи хем (Fe-порфиринов комплекс). Връзките между четирите вериги на хемоглобина са слаби, нековалентни: хидрофобни, полярни (йонни, йон-диполни, дипол-диполни) и водородни. Полученият тетрамер има биологична активност, а при разграждането му до субединици, се намалява афинитетът към кислород.

Фиг. 2-14. Хемоглобин - пример за белтък с четвъртична структура.
Четирите субединици, както и четирите хемове са представени с различен цвят.
Фигурата е приготвена с програмата Raswin [7], ползвайки атомните координати на файл 1hba [9] в PDB [10].

По-висшите нива на белтъчната молекула са детерминирани от първичната структура. За нейното първостепенно значение говори примера с HbS, който се отличава от нормалния HbА само по един аминокиселинен остатък в двете b-вериги, но това е причина за заболяване - сърповидно-клетъчна анемия (вж т.2.5.7 ).

2.2.7. Денатурация и ренатурация

Денатурацията е процес, при който под въздействия на различни химични и физични агенти (висока температура, киселини, основи, детергенти, лъчения) се нарушава конформацията на молекулата, променят се физикохимичните свойства и се губи биологичната активност. Тя може да бъде обратима или необратима. При обратимата денатурация след отстраняване на денатуриращото въздействие молекулата отново приема нативна конформация (ренатурация). На фиг. 2-15 е показана денатурация и ренатурация на рибонуклеаза. Тя има осем цистеинови остатъка, образуващи 4 дисулфидни връзки. При комбиниране на тези осем остатъци са възможни 105 конформации и само една от тях е нативна. Останалите 104 се означават като "разбъркана" конформация. В последно време се знае, че има специални ензими (протеин дисулфид изомерази), които улесняват образуване на правилните дисулфидни връзки.


Фиг. 2-15. Денатурация и ренатурация на ензима рибонуклеаза.
 В нативния ензим осемте цистеинови остатъци, представени чрез номерирани кръгчета, са свързани чрез дисулфидни връзки. В редуцирания денатуриран ензим всеки от осемте цистеинови остатъци има свободна тиолова група. В денатурирания окислен ензим има дисулфидни връзки, но не между "правилните" цистеинови остатъци, характерни за нативната конформация.

Възможността за ренатурация на рибонуклеаза и примерът с Hb S доказват, че първичната структура е определяща за структурата и свойствата на белтъчната молекула.

2.2.8. Нагъване на новосинтезирани полипептидни вериги

В клетките има специални белтъци, които улесняват процеса на нагъване. Наред със споменатите протеин дисулфид изомерази, които катализират преместване на дисулфидни връзки, това са шапероните и ензимите от групата на цис-транс пролил изомеразите.

Шапероните (70 kDa) са семейство белтъци, които при физиологични условия предотвратяват неправилното огъване и "нежеланите" взаимодействия между аминокиселинните радикали в новосинтезиращи се полипептидни вериги.

Първичната структура на белтъка детерминира неговите по-висши структури, но шапероните улесняват достигането на термодинамично най-стабилната белтъчна конформация. За правилното нагъване на новообразуващата се полипептидна верига шапероните се свързват временно с хидрофобните участъци на новообразуващата се верига, защитавайки ги от въздействието на разтворителя. За осъществяване на дейността си шапероните изискват енергия под форма на АТФ.

Шапероните се наричат още топлинно-шокови или стресови белтъци, тъй като се синтезират усилено при топлинен шок вероятно с цел да противодействат на денатурацията на клетъчните белтъци.

Освен това система от шаперони улеснява транспорта на белтъци в различни клетъчни отделения. Напр. един шаперон поддържа новосинтезирания белтък в разгънато състояние докато мине през митохондрийната мембрана, а друг шаперон в матрикса улеснява нагъването на белтъка.

За оформяне конформацията на новосинтезираните белтъчни молекули, пролил рацемазата катализира изоергичното цис-транс-превръщане на вече включен в полипептидната верига пролин.

2.3.-2.3.1. Връзка между белтъчната структура и биологичната функция: Резюме

Структурата и промени в структурата на белтъци са решаващи за функциите на белтъците. Това се илюстрира с примери за кислород-пренасящите белтъци миоглобин и хемоглобин, за колаген (главният структуробразуващ белтък) и за имуноглобулините (защитни антитела).

Глобуларните кислород-свързващи белтъци миоглобин и хемоглобин имат много близка вторична и третична структура. Тя осигурява подходящо обкръжение за еднаквия за двата белтъка хем (Fe-порфиринов комплекс), който свързва кислорода. Fe2+ йон в хема е координационно свързан към четирите N атоми от порфириновия пръстен и към N атом от Хис F8 (проксимален Хис). В окислено състояние шестата лиганда е О2, вмъкнат между Fe2+ йон и Хис Е7 ( дистален Хис).

Кривите за асоциация/дисоциация на кислород отразяват различията в свързването и отдаването на кислород от мономера Mb (с третична структура) и тетрамера Hb (с четвъртична структура) при различно парциално налягане на кислорода (рО2). Кривата за Мb е правоъгълна хипербола. Mb в мускулите лесно свързва отделения от Нb О2, съхранява го и го предава на митохондриите. Свързването не зависи от рН, СО2 и 2,3-бисфосфоглицерат.

Кривата за Нb е сигмоида и това е свързано с четвъртичната му структура. Свързването на О2 към първата субединица води до конформационни промени в останалите субединици, което улеснява свързването му. Този ефект се означава като положителна кооперативност. В белите дробове рО2 е около 90-100 mm Hg и там Hb е максимално наситен с О2. В тъканите рО2 е от около 40 mm Hg, а в капилярите - около 20 mm Hg. Тетрамерната структура позволява много по-голямо отдаване на О2 при по-ниски рО2 отколкото е възможно при единичната верига на Mb.

Повишеното съдържание на СО2 и протони в тъканните капиляри улеснява отделянето на О2 от оксиHb. Обратно, повишеното съдържание на О2 в белодробните капиляри улеснява отделянето на СО2 и протони от Hb. Тези взаимозависимости се означават като ефект на Бор.

НbА свързва отрицателно-заредения 2,3-бисфосфоглицерат в празнината между четирите субединици и това снижава афинитета на Hb към О2. В свързването участват три положително заредени групи от всяка b-субединица, една от които е Хис21. Феталният HbF вместо b вериги съдържа g вериги. В g веригите Хис21 е заменен със Сер. Поради това НbF има по-нисък афинитет за 2,3-фосфоглицерат и последният не инхибира свързването на О2 към НbF. Това позволява HbF да свързва лесно О2, освободен от майчиния HbA.

Колагенът е най-застъпеният белтък в нашето тяло, съставна част на екстрацелуларния матрикс. Известни са досега 30 различно кодирани полипептидни вериги, които при своето комбиниране дават 19 типа колаген, различната структура на които осигурява различните им функции.

Здравината на колаген тип I се обуславя от уникалния аминокиселинен състав и характерната първична структура с повтаряща се последователност от (Гли-X-Про/Хип). Всеки трети остатък е глицин. Има и хидрокси-пролин и хидрокси-лизин, получени чрез посттранслационни модификации. Тази първична структура предопределя спирала с ляв ход с параметри, отлични от тези на a-спиралата. Три полипептидни вериги с ляв ход образуват устойчива на развиване тройна суперспирала с десен ход, наречена тропоколаген, който е основната структурна единица на колаген. Трите вериги са в близък контакт и се свързват чрез водородни връзки. Само глицин, най-малката аминокиселина, приляга по размери в сърцевината на суперспиралата. Това обяснява защо глицин е на всяка трета позиция.

Вътреклетъчните посттранслационни модификации на проколаген са условие за образуване на тройната спирала. Извън клетките от проколаген се отцепват N- и С- крайните пропептиди. Получените тропоколагенови молекули се свързват една с друга и образуват колагенови фибрили. В тях всяка тропоколагенова молекула се отмества с около 23 % от своята дължина по отношение на съседните. Колагеновите фибрили се пакетират в колагенови влакна. В техните рамки продължава зреенето на колаген, водещо до по-нататъшно усилване здравината на колаген чрез образуване на стабилни ковалентни напречни връзки, усилващи якостта на влакната.

Имуноглобулините, наричани антитела, са защитни белтъци, които разпознават и свързват чужди за организма макромолекули, след което ги бележат и предават на фагоцитите за разрушаване. Всеки имуноглобулин се състои от две леки (L) и две тежки вериги (H), свързани помежду си чрез дисулфидни връзки. Известни са пет класа имуноглобулини: IgG, IgМ, IgА, IgE, IgD.

Всеки човек може да произвежда антитела срещу 106 [1] до 109 [16] антигени. Генерирането на такъв огромен брой антитела осигурява ефикасна защита срещу чужди макромолекули.

2.3.2.-2.3.2.1. Кислород-пренасящи белтъци. Структурни прилики между миоглобин и субединиците на хемоглобин, важни за свързването на кислород

Структурата на глобуларните белтъци миоглобин (Mb) и тетрамера хемоглобин (Hb) е идеално пригодена за изпълнение на функциите им. Hb пренася О2 от белите дробове до тъканите, а обратно СО2 и протони. Mb съхранява О2 в мускулите и го пренася до митохондриите. За целта Mb трябва да може да свързва О2 добре при ниското рО2 в тъканите, при което Hb освобождава кислород.

И двата белтъка свързват О2. Почти идентичната вторична и третична структура на мономера Mb и на субединиците на тетрамера Нb осигурява подходящо обкръжение за желязо-порфириновия пръстен (хем), който е пряко ангажиран в свързването на О2. Без хем веригата се денатурира и не може да свързва кислород. Полипептидната верига е така нагъната в пространството, че повечето от хидрофобните остатъци са във вътрешността на молекулата, а полярните са по нейната повърхност. Fe2+ йон в хема е координационно свързан към четирите N атоми от порфириновия пръстен и към N атом от Хис F8 (дистален Хис). В окислено състояние шестата лиганда е О2, вмъкнат между Fe2+ йон и Хис Е7 (проксимален Хис). Плоскостта на хема е разположена във хидрофобна гънка близо до повърхността, където Fe2+ йон е защитен от окисление. Mb и Hb без хем или с окислен Fe3+ йон в хема (метмиоглобин и метхемоглобин) не могат да свързват кислород.

2.3.2.2. Разлики в кривите за асоциация/дисоциация на кислород при Mb и Hb

Тези криви отразяват различията в свързването и отдаването на кислород от мономера Mb (с третична структура) и тетрамера Hb (с четвъртична структура) при различно парциално налягане на кислорода (рО2). Р50 е това рО2, при което белтъкът е наситен наполовина с О2. За миоглобин Р50 = 2.8, а за хемоглобин Р50 = 26.

Кривата за Мb е правоъгълна хипербола (фиг. 2-16). При ниското рО2 в мускулите (20-40 mm Hg) около 90 % от Mb e наситен с О2 и не го отдава. Едва когато рО2 спадне към 5 mm Hg, миоглобинът започва да отдава О2 на митохондриите.

       Фиг. 2-16. Криви на асоциация/дисоциация на кислород от миоглобин и хемоглобин в зависимост от парциалното му налягане (рО2).

За разлика от него, хемоглобин освобождава по-лесно О2 в тъканите. Кривата за Нb е сигмоида и това е свързано с четвъртичната му структура. В дезокси-състояние конформацията на тетрамера Hb се означава като T форма (от англ. tight). Свързването на О2 към първата субединица води до конформационни промени в останалите субединици, което улеснява свързването му от тях. Този ефект се означава като положителен кооперативен ефект на свързване. Конформацията на окси-Hb се означава като R форма (от англ. relaxed). В белите дробове рО2 е около 90-100 mm Hg и там Hb е максимално наситен с О2. В тъканите рО2 е около 40 mm Hg, а в капилярите - около 20 mm Hg. Свързването на веригите в тетрамер позволява много по-голямо отдаване на О2 при тези по-ниски рО2 отколкото е възможно при единичната верига на Mb.

Концентрациите на СО2, протони и 2,3-бисфосфоглицерат не повлияват свързването на О2 към Mb в тъканите, но за Hb влиянието на тези три ефектора се описва с т. н. ефект на Бор. Повишеното съдържание на СО2 и протони в тъканите, както и наличието на 2,3-бисфосфоглицерат изместват кривата за Hb надясно, което улеснява отделянето на О2 от оксиНb в тъканите. Обратно, повишеното съдържание на О2 в белите дробове улеснява отделянето на СО2 и протони от Hb.

2.3.2.3. Разлики в структурата на HbA и HbF

HbA (a2b2) свързва отрицателно-заредения 2,3-бисфосфоглицерат в централната празнина между четирите субединици (фиг. 2-17). Това снижава афинитета на Hb към О2 и стабилизира дезокси-формата Т. В свързването на отрицателно-заредения 2,3-бисфосфоглицерат участват по три положително заредени групи от всяка b-субединица (амино-група от N-крайния Вал, Лиз ЕF6 и Хис21).

Феталният HbF (a2g2) съдържа две a и две g вериги (вместо 2 b вериги). В g веригите на HbF Хис21 е заменен със Сер. Поради тази структурна разлика НbF има по-нисък афинитет за 2,3-фосфоглицерат и последният влияе много по-слабо върху свързването на кислород към НbF (не го инхибира). За HbA P50 = 26 mm Hg, а за HbF P50 = 20 mm Hg. Това позволява HbF да извлича (да свързва лесно) О2, освободен от майчиния HbA.


 Фиг. 2-17. Свързване на 2,3-бисфосфоглицерат (2,3-БФГ) към двете b-субединици на деоксиHbА посредством електростатични взаимодействия. Вляво - формула на 2,3-бисфосфоглицерат с пет отрицателни заряди; Вдясно - йонни връзки между петте отрицателно заредени групи на 2,3-БФГ и положително заредените Лиз ЕF6, Вал NA1 и ХисН21 от всяка от двете b-субединици.

2.3.3.-2.3.3.1. Колагени. Различни типове колаген

Колагенът е най-застъпеният белтък не само в екстрацелуларния матрикс, но и въобще в тялото. Той съставлява около 25 % от белтъците в тялото, като концентрацията му варира: 4 % в черния дроб, 10 % в белите дробове, 12-24 % в аортата, 50 % в хрущялите, 64 % в корнеата, 23 % в кортикалните кости, 74 % в кожата [16]. Известни са засега 30 различни полипептидни вериги за колаген, всяка кодирана от различен ген. В зависимост от комбинацията им и от съдържанието на допълнителни въглехидратни съставки, са установени 19 типа колаген [17]

Различната структура на тези типове колаген осигурява различните им функции. В очната корнея колагенът е прозрачен, в костите и зъбите той съдържа калциево-фосфатен полимер хидроксилапатит, кожният колаген е с хлабави и гъвкави влакна. Характерната за колаген тип I тройна спирала се среща в повечето от другите типове колаген, но дължината є може да варира, а освен това някои от колагените съдържат и глобуларни участъци в N- и C-краищата.

2.3.3.2. Структура на колаген, тип I

Колаген тип I има уникален аминокиселинен състав (вж табл. 2-4). От общо 1050 остатъци в полипептидната верига 33 % са глицин, т. е. всеки трети остатък е глицин. Освен това има и необичайни остатъци: 3-хидрокси-пролин, 4-хидрокси-пролин и 5-хидрокси-лизин, получени чрез посттранслационни модификации (вж т. 2.5.6). По протежение на веригата се повтаря последователността (Гли-X-Про/Хип), където Хип е хидроксипролин, а Х - коя да е аминокиселина [18].

Табл. 2-4. Аминокиселинен състав на колаген тип I*
Аминокиселинен остатък %
глицин 33
пролин 10
3-хидроксипролин и 4-хидрокси-пролин 10
хидроксилизин 1
други 46

*По данни на [17].

Високият процент на глицин и пролин и наличието на хидроксипролин и хидроксилизин не е случаен. Характерната първична структура предопределя възникването на особен тип спирала с ляв ход, (подобна на спиралата, образувана от синтетичен полипролин (т.н. полипролинова спирала, тип II, чиито параметри са сравнени в табл. 2-3 с тези на други вторични структури). Този тип спирала не съдържа вътрешно верижни водородни връзки. Три полипептидни вериги (две a1 и една a2 вeриги) с ляв ход образуват тройна суперспирала с десен ход (фиг. 2-18), наречена тропоколаген, който е основната структурна единица на колаген. Трите вериги са в близък контакт, както личи от напречния пререз. Веригите се свързват една с друга чрез водородни връзки. Само глицин, най-малката аминокиселина, приляга по размери в сърцевината на суперспиралата. Това обяснява защо глицин е на всяка трета позиция.


 Фиг. 2-18. Структура на проколаген, тропоколаген и колагенови фибрили (тип I).
Най-горе: тройна спирала на проколаген с десен ход, съдържаща три спирали с ляв ход от полипролинов тип II (вж табл. 2-3). Първоначално образуващите се сигнални препропептиди не са представени. Виждат се само пропептидите в амино- и карбоксилния край.
В средата: В по-едър план в една от веригите е показан повтарящият се елемент в първичната структура, а в другата е представена вторичната структура. Напречният пререз на тропоколаген (по-долу вдясно) показва необходимостта всеки трети остатък да бъде глицин, за да се осъществи близък контакт между веригите. Плътният черен правоъгълник се използва като съкратено изображение на тропоколагеновата молекула, за да се покаже участието й във формиране на колагеновите фибрили. Тропоколаген се получава след поредица от промени в тройната спирала: различни вътреклетъчни химически модификации (описани в текста), екзоцитоза и извънклетъчно отстраняване на крайните пропептиди. Ковалентните напречни връзки, образуващи се във и между отделните тропоколагенови молекули водят до бавно зреене на колаген.
Най-долу: Във формиращите се колагенови фибрили има характерно (около 23 %) отместване на тропоколагеновите молекули една спрямо друга. Пакетирането на фибрилите във влакна не е представено.

Тройната суперспирала е много устойчива на развиване, тъй като тя е с десен ход, а съставящите я три спирали - с обратен ляв ход (принцип, използван и при изработване на здрави стоманени конструкции).

Тропоколагеновите молекули се обединяват във фибрили, като всяка тропоколагенова молекула се отмества с около 23 % от своята дължина по отношение на съседните. Между отделните молекули остава празни пространства, в които в костите се отлага хидроксилапатитни кристали.

2.3.3.3. Значение на следсинтетичната обработка (зреене) на колаген за здравината на колагеновите фибрили

Първоначално синтезираните a-вериги в ендоплазмения ретикулум са под форма на препроколаген, съдържащи в N-края сигнален "пре"-пептид, насочващ полипептидната верига във весикулите на ендоплазмения ретикулум. След отделянето на сигналния пептид се получава проколаген, който съдържа пропептиди (в N-края 150 остатъка и 250 остатъка в С-края).

Вътреклетъчните посттранслационни модификации на проколаген започват с хидроксилиране на пролин и лизин. Определени хидроксилизинови остатъци се гликозилират с галактозни или глюкозни остатъци (създават се О-гликодидни връзки). Определени аспарагинови остатъци се гликозилират (създават се N-гликозидни връзки). Образуват се дисулфидни връзки (вътрешно верижни в N-пропептидите, а в С-пропептидите вътрешно-верижни и междуверижни).

Описаните модификации са условие за образуване на тройната спирала. След това проколагенът се транспортира до апарата на Голджи, където завършва О-гликозилирането и проколагенът се секретира извън клетките.

Извън клетките от проколаген се отцепват N- и С- крайните пропептиди. Получават се тропоколагенови молекули, които се свързват една с друга, и образуват колагенови фибрили. В тях всяка тропоколагенова молекула се отмества с около 23 % от своята дължина по отношение на съседните. Колагеновите фибрили се пакетират в колагенови влакна. В техните рамки продължава зреенето на колаген, водещо до по-нататъшно усилване здравината на колаген. Лизил оксидаза катализира окислително дезаминиране на e-амино-групи на лизин и хидроксилизин до алдехиди. Тези реактивни алдехиди реагират помежду си (алдолна кондензация) или с неокислени лизини дават Шифови бази. Чрез тези две реакции се формират стабилни ковалентни напречни връзки, усилващи якостта на влакната.

2.3.4. Имуноглобулини

Имуноглобулините, наричани антитела, са защитни белтъци, които разпознават и свързват чужди за организма макромолекули (белтъци, нуклеинови киселини, полизахариди), след което ги бележат и предават на фагоцитите за разрушаване. Антитела се образуват и срещу ниско-молекулни вещества, ако са прикрепени към макромолекула. Групата, която се разпознава от антитялото, се нарича антигенна детерминанта или епитоп.

Имуноглобулините се синтезират от плазмени клетки, произлизащи от В-лимфоцитите. Известни са пет класа имуноглобулини (табл. 2-5).

На фиг. 2-19 е представена схематично структурата на имуноглобулин от най-разпространения клас IgG. Всеки имуноглобулин се състои от две леки (L от англ. light) и две тежки вериги (H от англ. heavy), свързани помежду си чрез дисулфидни връзки.

Фиг. 2-19. Схема за структурата на имуноглобулин от клас IgG.
Молекулата съдържа две тежки вериги (H) и две леки вериги (L). СH и VH - константен (непроменлив) и вариабилен (променлив) участък в тежката верига; СL и VL - константен и вариабилен участък в леката верига; СНО - въглехидратна съставка. Хипервариабилните участъци са в жълт цвят, а антиген-свързващите участъци са означени със стрелки.

В рамките на всяка от веригите има и вътрешноверижни дисулфидни връзки. Всяка от веригите съдържа вариабилен (V от англ. variable) и константен (С от англ. constant) участъци. Леките вериги съдържат 220, а тежките 440 аминокиселинни остатъци. Вариабилните участъци на L и Н веригите оформят две места за свързване на определен антиген. Н веригите са гликопротеини (съдържат въглехидратна съставка).

Вариабилните места за свързване на антигена са специфични, а константните участъци са еднакви за всички имуноглобулини в даден клас. <з>Останалите четири класа имуноглобулини се отличават от IgG по вида на тежката верига, по броя на мономерите, по застъпеността в серума (вж табл. 2-5) и по функциите, които изпълняват. Секретираният имуноглобулин може да бъде под форма на мономер (М), димер (D), тример (T), или пентамер (P). IgD няма секреторна форма.

Табл. 2-5. Видове имуноглобулини в зависимост от вида на тежката верига*

Клас
имуноглобулини
Тежка верига
H
Лека верига
L

Структура
Kонцентрация
в серума (mg/dL)
IgA a l или k l2a2 или k2a2
M, D, T**
200
IgD d l или k l2d2 или k2d2
-
3
IgE e l или k l2e2 или k2e2
М
0.05
IgG g l или k l2g2 или k2g2
M
1000
IgM m l или k l2m2 или k2m2
P
120

* По данни на [1] и [19]
** M - мономер, D - димер, T- тример, P - пентамер; IgD няма секреторна форма.

IgG са основният и най-масово представен в кръвта клас антитела. Чрез Н-веригите те се прикрепват към рецептори на фагоцити, които поглъщат и разрушават свързания от IgG антиген (микроорганизъм). IgG могат да се свързват и към белтъци от системата на комплемента и да ги активират. Единствено IgG могат да преминават през плацентата от майката в плода.

IgМ са първите антитела, които се синтезират в В-лимфоцитите. При диференциация на В-лимфоцитите могат да се образуват различни антитела срещу един и същи антиген. В резултат на разместване на гени в ДНК L-вериги от IgМ могат да се прегрупират с Н-вериги от друг клас и така да се получат и други имуноглобулини IgA, IgG или IgE, които са с еднаква антигенна специфичност като изходния IgM ( този процес се нарича превключване от клас в клас).

IgA се съдържат в слюнка, сълзи, мляко, чревни секрети като мономери, димери или тримери. IgE участват в алергични реакции с увеличено освобождаване на хистамин. Участват и в защитата срещу чревни паразити.

Функцията на IgD е неясна.

Всеки човек може да произвежда антитела срещу 106 [1] до 109 [19] антигени. Генерирането на такъв огромен брой антитела осигурява ефикасна защита срещу чужди макромолекули. То е възможно поради комбинацията и пренареждането на различни структурни гени, отговорни за синтезата на вариабилните участъци в Н и L веригите ( виж глава 15).

2.3.5. Инсулин

Както бе посочено (т. 2.2.2, фиг. 2-5 и 2-6), инсулин се синтезира като по-високомолекулен предшественик препроинсулин. Сигналният пептид в N-края (с 23 остатъци) е необходим за насочване на полипептидната верига към цистерните на ендоплазмения ретикулум, след което той се отделя, тъй като повече не е необходим. Получаващият се проинсулин съдържа от N-към С-края фрагментите, съответстващи на В-веригата, С-пептида (свързващ пептид) и А-веригата. Ролята на С-пептида е да осигури правилна конформация, за да могат да се образуват правилните дисулфидни връзки (фиг. 2-7 и фиг. 2-6). След това С- пептид, заедно с още два дипептида, бива отделен. Активният инсулин има кратък полуживот в кръвта (3-5 минути). Наличието на дисулфидни връзки позволява лесно и бързо дезактивиране на хормона чрез тяхната редукция под действие на специфичен ензим (глутатион-инсулин трансхидрогеназа).
За клиничното приложение на тези познания- вж т. 2.5.4. и глава 18; за производството на човешки инсулин чрез генно инженерство - виж т. 16.7.7.

Други примери включват рецепторите, свързващи специфично определени хормони и предаващи хормоналния сигнал в клетката (глава 17), регулаторните хромозомни белтъци (глава 3) и други. На ензимите и техните функции е посветена глава 4.

2.4.-2.4.1. Методи за пречистване на аминокиселини, пептиди и белтъци: Резюме

Съдържащите се в биологични течности аминокиселини и белтъци се изолират и пречистват, за да е възможно тяхното измерване, изучаване и използване. Разделянето (фракционирането) се постига чрез различни методи въз основа на различия по сумарен заряд, молекулни размери, разтворимост, афинитет към специфични вещества и др. свойства.

Електрофорезата е метод за разделяне на заредени молекули въз основа главно на различия в сумарния им заряд. Посоката на придвижване към един от полюсите на външно електрично поле се определя от знака на сумарния заряд на молекулите, а скоростта на придвижване - от съотношението заряд/молекулна маса, както и от интензитета на полето, формата на молекулите и структурата на носещия гел. При рН = или > 8.6 серумните белтъци са заредени отрицателно и в агарозен гел се разделят на следните фракции: албумин, a1-, a2- и b-глобулини и g-глобулини.

Изоелектричното фокусиране, SDS-полиакриламидната електрофореза и капилярната електрофореза са важни разновидности на електрофорезата.

При хроматографските техники веществата се разпределят между статична и подвижна фаза. Разделянето зависи от относителната способност на веществата да се свързват по-силно с едната или другата фаза. При разпределителната хроматография аминокиселините се разделят въз основа на различната им разтворимост в два несмесващи се разтворители (полярен и неполярен).

При йонообменната хроматография аминокиселините, пептидите и белтъците се разделят въз основа на зарядови различия. При нея смес от аминокиселини (напр. белтъчен хидролизат) се пропуска през колона, съдържаща йонообменна смола със заредени групи, които свързват противоположно заредените аминокиселини. Чрез създаване на градиент за рН и солевата концентрация на елуентите, отделните аминокиселини се отмиват постепенно от колоната и се разделят. В съвременния вариант йонообменната хроматография се прилага в специални апарати под високо налягане (HPLC-техника), осигуряващо изключително висока разделителна способност и повторимост на резултатите. При обратно-фазовата HPLC-техника смолата съдържа хидрофобни групи, за да се свържат и забавят хидрофобните молекули. В този случай елуирането от колоната става с органични разтворители. Цялата процедура в аминокиселинните анализатори (елуиране, събиране на отделни фракции, анализ на всяка фракция, записване на резултатите е автоматизирана.

Афинитетната хроматография се основава на специфично нековалентно свързване на белтъци към различни лиганди, вкл. и антитела, прикрепени към хроматографска колона. Последващото елуиране се прави с чист лиганд в по-висока концентрация отколкото тази на свързания към колоната лиганд.

В клиничната практика тези методи се използват както за диагностика на заболявания, така и за препаративно получаване и пречистване на различни биопродукти.

2.4.2.-2.4.2.1. Електрофоретични техники - принцип

Електрофорезата е метод за разделяне на заредени молекули или по-големи частици въз основа главно на различия в сумарния заряд. Посоката на придвижване към един от полюсите на външно електрично поле се определя от знака на сумарния заряд на молекулите. Скоростта на придвижване се определя от съотношението заряд/молекулна маса. Освен това разделянето зависи и от интензитета на полето и формата на молекулите в сместа, както и от структурата на носещия гел (агаров, агарозен, целулозно-ацетатен, полиакриламиден гел, хартия или друг). При подбиране на различни експериментални условия електрофоретичните методи се прилагат успешно както за разделяне на смеси от аминокиселини, така и на смеси от пептиди и белтъци в аналитичен и в препаративен вариант. Буферът, в който се разтваря сместа за разделяне, се избира да има рН, различно от рI на веществата, които трябва да се разделят или пречистват. При pН>pI, аминокиселините и белтъците са заредени отрицателно и се движат към анода. При рН<рI те са заредени положително и се движат към катода.

2.4.2.2. Агарозна електрофореза на серумни белтъци

Плазмените белтъци имат йоногенни групи, които определят сумарния заряд на дадена белтъчна молекула. При разделяне на тези белтъци чрез електрофореза върху агарозен гел обикновено се използва буфер с рН = или > 8.6. Изоелектричните точки на плазмените белтъци са между 5 и 7. При рН = или > 8.6 и над него те са заредени отрицателно и движейки се към анода с различна скорост, изминават различно разстояние и се разделят на следните фракции: албумин, a1-, a2- и b-глобулини, фибриноген и g-глобулини (фиг. 2-20). В клиничната практика се предпочита използването на серум вместо плазма, тъй като фибриногенът на плазмата може да бъде взет погрешно за парапротеин. При сканиране на електрофореграмата се получава т.н. денситограма, в която на всяка фракция съответства пик с определена ширина и височина. От площта под всеки пик може количествено да се определи даден белтък. Тези фракции са сумарни и съдържат множество индивидуални белтъци, които могат да бъдат допълнително разделени и пречистени чрез по-прецизни техники, напр. полиакриламидна електрофореза, имуноелектрофореза или други. Въпреки това, поради наличие на главен белтък във всяка от тях, електрофоретичният анализ на плазмени или серумни белтъци върху агарозен гел е полезен и често използван метод в диагностиката (виж т. 2.5.2).

Фиг. 2-20. Електрофореза на серумни белтъци от здрав човек върху агарозен гел, трис-вероналов буфер, рН 9.2. Горе - електрофореграма, долу денситограма. В посока към анода най-бързо се движи албумин, следван от a1, a2, b, g-глобулини.
Електрофореграмата и денситограмата са любезно предоставени от доц. Н. Койчева и гл. ас. Н. Деникова от Катедра по клинична лаборатория и имунология, Медицински Университет-София.

2.4.2.3. Други електрофоретични техники

При изоелектрично фокусиране се създава рН градиент в електрично поле с помощта на полиамино-поликарбоксилови киселини с известни рI, наречени амфолини. Всеки белтък от сместа се движи до такъв участък от градиента, който има рI, еднакво с това на белтъка. Поради високата разделителна способност и непредвидено свързване на амфолините с белтъци от пробата са възможни артефакти, т.е да се открият повече фракции от действително наличните.

SDS-полиакриламидната електрофореза разделя белтъците въз основа нa техния размер. SDS е съкращение от английското название на натриев додецил сулфат (Sodium Dodecyl Sulfate). Белтъците се нагряват в присъствие на SDS и редуциращ агент (меркаптоетанол), което води до разкъсване и редуциране на дисулфидните връзки и топлинна денатурация. С това към разтвора се експонират хидрофобни групи, скрити преди това в нативната структура. Те свързват додециловия радикал и около белтъка се образуват отрицателно заредени мицели от SDS-молекули. При полиакриламидна електрофореза всички белтъци, обградени от тези мицели, се движат към анода, като по-големите молекули се движат по-бавно от по-малките поради ситовия ефект на гела.

Капилярната електрофореза се използва засилено напоследък за диагностика поради високата скорост на разделяне (за няколко минути) и поради това, че са нужни много малки количества от изследваните вещества. При този метод се провежда свободна електрофореза в капилярни тръбички с диаметър 0.05-0.3 mm. Около отрицателно заредените стени на капилярките се движи поток от катиони към катода, увличайки със себе си разделяните молекули, независимо от техния заряд. Положително заредените молекули се движат с този поток най-бързо, последвани от неутралните и отрицателно-заредените молекули.

2.4.3.- 2.4.3.1. Хроматографски методи. Разпределителна хроматография

При хроматографските техники веществата се разпределят между статична и подвижна фаза. Разделянето зависи от относителната способност на веществата да се свързват по-силно с едната или другата фаза.

Чрез разпределителната хроматография аминокиселините се разделят въз основа на различната им разтворимост в два несмесващи се разтворителя. Единият разтворител е полярен - обикновено вода, фиксирана неподвижно чрез водородни връзки върху твърд носител (напр. хартия). Другият разтворител е органичен. Подходящ неполярен разтворител за аминокиселините е n-бутанол. Този неполярен разтворител се всмуква от твърдия носител, пълзи по него и затова се нарича подвижна фаза. Хидрофобните аминокиселини се разтварят в различна степен в органичния n-бутанол и заедно с него пълзят по хартията с различна скорост. Водноразтворимите аминокиселини изостават в своето движение. След време сместа се разделя на отделни аминокиселини, които се проявяват (стават забележими по хартията) след оцветяване с нинхидрин или флуорескамин. Оцветяването на аминокиселинните петна с нинхидрин позволява количественото им определяне при наличие на дори само на 1 mg от тях. Флуорескамин е хиляда пъти по-чувствителен и улавя количества от аминокиселини от порядъка на 1 ng. Идентифицирането на неизвестните петна става чрез сравняване на техните Rf-стойности с тези на стандартните двадесет аминокиселини (свидетели). Rf-стойността е отношението между пътя, изминат от аминокиселината, и пътя, изминат от разтворителя.

2.4.3.2. Йонообменна хроматография

При този метод аминокиселините, пептидите и белтъците се разделят въз основа на зарядови различия. Това е най-използваният съвременен метод за разделяне, доказване и определяне на аминокиселини в белтъчен хидролизат. При нея хидролизатът се пропуска през колона, съдържаща йонообменна смола със заредени групи, които свързват противоположно заредени аминокиселини. Чрез създаване на градиент за рН и солевата концентрация на елуентите, отделните аминокиселини се отмиват постепенно от колоната и се разделят.

В съвременния вариант йонообменната хроматография се прилага в специални апарати под високо налягане (HPLC-техника - англ. High Pressure Liquid Chromatography), осигуряващо изключително висока разделителна способност и повторимост на резултатите. При обратно-фазовата HPLC-техника смолата съдържа хидрофобни групи, за да се свържат и забавят хидрофобните молекули. В този случай елуирането от колоната става с органични разтворители. Колкото е по-висок процентът на органичния разтворител, толкова по-бързо се извличат неполярните компоненти. Цялата процедура в аминокиселинните анализатори (елуиране, събиране на отделни фракции, анализ на всяка фракция, записване и отпечатване на резултатите) е напълно автоматизирана. В съвременните клинични лаборатории така се разделят аминокиселини от плазма на пациенти с диагностична цел (фиг. 2-21).


Фиг. 2-21. HPLC-хроматография на аминокиселини в плазма на новородено. Използвана е обратно-фазова колона. Аминокиселините се определят по флуоресценцията на техните производни, получени при въздействие с ОРА (орто-фталалдехид). Хроматограмите са любезно предоставени от М. Иванова и И. Кременски, лаборатория по молекулярна патология, Медицински Университет-София. Над всеки пик апаратът изписва латинското съкращение на аминокиселина: asp - аспартат, glu - глутамат, asn - аспарагин, ser- серин, gln - глутамин, his - хистидин, gly - глицин, tre - треонин, citr - цитрулин, tau - таурин, ala - аланин, tyr - тирозин, aaba - a- аминоизобутират, met - метионин, val - валин, inst - вътрешен стандарт, phe - фенилаланин, ileu - изолевцин, leu - левцин, orn - орнитин, lys - лизин. Стойностите се отчетени спрямо референтни нормални граници за плазмени аминокиселини от 100 здрави деца за възрастовата група от 0 до 30 дни. Пикът за фенилаланин е много висок, тъй като детето е със заболяването фенилкетонурия - виж т. 2.5.3.

Подборът на експерименталните условия дава възможност чрез йонообменна хроматография да се разделят успешно и с много висока чувствителност най-различни белтъци. На фиг. 2-22 е даден пример за разделяне на модифицирани с пиридоксалфосфат цитохроми c, различаващи се по мястото на заместване и по броя на заместените лизинови остатъци. Наред с немодифицирания бeлтък (N) се виждат три монозаместени по различни лизинови остатъци производни (Ia, Ib, Ic), три дизаместени (IIa, IIb, IIc) и едно тризаместено производно (III). Сравняването на тези модифицирани белтъци по отношение на биологичната им функция позволява да се правят изводи за ролята на конкретни лизинови остатъци в цитохром c като електронен преносител в дихателната верига (вж гл.5).
<><><<!-- /-->

     Фиг. 2-22. Йонообменна хроматография на белтъци. Модифицирани с пиридоксалфосфат цитохроми c по един, два или три лизинови остатъци, са разделени върху колона с йонообменна смола Аmberlite CG-50, предварително стабилизирана с 0,01 М фосфатен буфер с рН 8.0. С пунктир е даден стъпаловидният градиент на NaCl в същия буфер за извличане на белтъците.
.

Елуационната крива e измерена при 530 nm. Фракциите се разделят както е означено с пунктира.
N - немодифициран цитохром c;
Iа, Ib, Ic - три различни монозаместени производни;
IIа, IIb, IIc - три различни дизаместени производни;
III - тризаместенопроизводно на цитохром c.

2.4.3.3. Афинитетна хроматография

Този мeтод се основава на специфично нековалентно свързване на белтъци към различни лиганди, вкл. и антитела, прикрепени към хроматографска колона. При пропускане на смес от белтъци в такава колона, този, който има афинитет към специфично подбраните лиганди, се свързва, а другите преминават през колоната. След отмиване на техните следи, свързаният белтък се елуира с по-висока концентрация на чист лиганд, който се конкурира за белтъка със свързания в колоната лиганд.

2.5.-2.5.1. Примери за приложение на познанията върху белтъци в клиничната практика: Резюме

Познанията за белтъци, както и методите за пречистване на аминокиселини и белтъци, намират приложение в клиничната практика. Разделянето на серумни белтъци чрез електрофореза се използва за диагностика на различни заболявания, тъй като електрофореграмата и денситограмата при заболяване се различават в качествено и количествено отношение от тези за здрав човек. Доказването на фенилкетонурия или друга аминоацидурия в новородени е възможно благодарение на чувствителни HLPC-техники за определяне на аминокиселини в плазма.

Познаването на първичната структура на инсулина от различни видове показа, че свинският инсулин се различава от човешкия само по един аминокиселинен остатък. Поради това този инсулин беше използван дълго време до получаване на човешки инсулин чрез генно инженерство, а и досега се ползва за лечение на диабет.

Определянето на гликозилиран хемоглобин дава информация за нивата на кръвна глюкоза за предшестващите два-три месеца и е полезно за контролиране кръвните нива на глюкоза при диабетици.

Познанията върху структура и зреене на колагенови влакна обясняват причината за възникване на скорбут - при липса на витамин С не се хидроксилират пептидно-включени пролин и лизин в тройната спирала на колаген.

Познаване структурата на нормален хемоглобин (HbА) и на други патологични хемоглобини позволява да се разберат причините за различни хемоглобинпатии, напр. сърповидно-клетъчна анемия, при която само един остатък (Глу) в b-веригите на Hb e заместен с Вал.

По съвсем нов, неизвестен до скоро механизъм, възникват заразните прионови болести ("луда крава" по говедата, болест на Creutzfeldt-Jacob по човека и др.). В прионовите белтъци, които са открити в болни индивиди или животни, не участват нуклеинови киселини. Тези белтъци са с еднаква първична структура като някои нормално срещащи се белтъци в мозъчна тъкан, но с променена вторична и третична структура. Превръщането на нормалния белтък (с a-спирални участъци) в патологичен (с b-листове) става вероятно под въздействие на друг белтък. Патологичният белтък служи като матрица за пренагъване на нормалния белтък. Това налага преосмисляне (допълване) на идеята за определящата роля на първичната структура спрямо по-висшите структури на белтъка. Очевидно за нагъването на белтъците, значение имат и други, макар и неизвестни засега, фактори.

2.5.2. Електрофореза на серумни белтъци за диагностика на различни заболявания

При различни заболявания се установяват количествени и качествени изменения в електрофоретичния профил (фиг. 2-23 - проби 2-9), в сравнение с нормалния профил 1.

  Фиг. 2-23. Електрофоретични профили на серумни белтъци от здрав човек (проба 1) и пациенти с различни заболявания (проби 2-10), описани в текста, върху агарозен гел, трис-вероналов буфер, рН 9.2.
Електрофореграмата и денситограмите са любезно предоставени от доц. Н. Койчева от Катедра по клинична лаборатория и имунология, Медицински Университет-София.

При профил 2 са увеличени a2 и b-глобулините, а при профил 3 са увеличени a2-глобулините, което е характерно за остро протичащи възпаления, предизвикани от инфекции, нараняване, хирургически травми и др.

При профил 4 са силно увеличени g-глобулините (поликлонална гамапатия). Тези имуноглобулини се увеличават неспецифично при голям брой различни инфекции и автоимунни болести. Увеличението се дължи на увеличена синтеза в различни клетъчни линии, затова имунният отговор се нарича поликлонален.

При профил 5 обратно, те са силно понижени (хипогамаглобулинемия), характерно за имунодефицитни състояния (намален хуморален имунитет), вкл. и СПИН.

При профил 6 се наблюдава b-g -сливане, характерно за чернодробна цироза.

При профил 7 се наблюдава повишение на a1- и a2-глобулините, характерно за възпалителни процеси и злокачествени остро протичащи болести.

При профили 8 и 9, обратно на профил 4, се вижда моноклонална гамапатия (парапротеин). Клетките от една клонова линия, размножавайки се, произвеждат идентични антитела, представени с характерен тесен единичен пик. Този моноклонален имуноглобулин, интактен или фрагмент от него, се означава като парапротеин.

Парапротеини се откриват при миелома с характерни костни метастази и при заболявания, свързани с дефекти в тежките вериги на имуноглобулините. Парапротеини могат да се получат от всеки имуноглобулинов клас. При миелома е увеличено производството на моноклонални леки вериги. Те са достатъчно малки, за да преминат в урината, където са известни като белтъци на Bence-Jones (фиг. 2-5, проба 10 от електрофореграмата). В някои пациенти могат да се открият парапротеини без видима патология (мека парапротеинемия). В тези случаи трябва да се провери и изключи със сигурност възможността за миелома.

2.5.3. Установяване на фенилкетонурия и други аминоацидурии чрез HPLC-техники

Описаните в т. 2-4 техники са полезни не само за теоретичната биохимия, но и в клиничната практика за установяване на промени в нивата на аминокиселини в кръвната плазма или урина при различни наследствени дефекти в обмяната и екскрецията на аминокиселини.

Установяването на фенилаланин в урина или повишена концентрация на фенилаланин в кръвта на новородени е в основата на масовия скрининг за откриване на фенилкетонурия сред новородени бебета. Обикновено това става с по-евтина микробиологична проба, а потвърждаването - чрез йонообменна хроматография, вариант HPLC (фиг. 2-21). Фенилкетонурията (вид малоумие, наричан олигофрения фенилпирувика) е най-често срещаната аминоацидурия. Дължи се на дефект в обмяната на фенилаланин. Опростена схема за разграждането на фенилаланин е дадена на фиг. 2-24.


Фиг. 2-24. 
Опростена схема за възникване и проявления на фенилкетонурия, откривана в новородени по увеличената концентрация на фенилаланин в кръвта или по наличието му в урина. Ранното откриване е важно за предотвратяване увреждането на централната нервна система. Ензимният блок при недостатъчност на фенилаланин хидроксилазата е представен с дебела червена линия. Стрелките нагоре означават повишена концентрация, а надолу - намалена концентрация на съответното вещество.

Нормално фенилаланин се превръща в тирозин под действие на ензима фенилаланин хидроксилаза, а от тирозин се получават важни продукти (хормони на щитовидната жлеза, хормоните на надбъбрека норадреналин и адреналин и кожните пигменти меланини). При недостатъчност на ензима фенилаланин хидроксилаза се натрупва фенилаланин, който в страничен път се разгражда до фенилпируват и фениллактат - вещества, токсични за централната нервна система. Тези и други продукти се откриват в урината. Освен това, не се образуват продуктите на тирозин. Ако не се вземат мерки, детето израства малоумно. За да се спаси такова бебе, веднага се спира кърменето. Всяко забавяне снижава сериозно коефициента на интелигентност. Детето се храни поне до седем години, а по-добре цял живот с изкуствени белтъчни смеси, не съдържащи фенилаланин (или само в минимални количества за белтъчна биосинтеза), но съдържащи тирозин. За такъв индивид тирозинът става незаменима аминокиселина.

Освен фенилкетонурията, известни са и други аминоацидурии като цистин-лизинурия, болест на Хартнуп (дефект в транспорта на неутралните аминокиселини), синдром на Fanconi (обща аминоацидурия) и др., които също се установяват чрез HPLC-техники.

2.5.4. Приложение на животински инсулини за лечение на захарен диабет

Първичната структура на хормона инсулин и неговия прекурсор проинсулин бе разгледана в т. 2.2.2. (фиг. 2-6 и фиг. 2-7). Сравняването на първичната структура на инсулин от различни видове показва идентичност на аминокиселинните остатъци с изключение на остатъци 8, 9 и 10 във верига А и остатък 30 във верига В. Тези остатъци вероятно не са съществени за биологичната роля на инсулин (табл. 2-6).

Табл. 2-6. Сравняване на част от първичната структура на инсулин в различни видове спрямо човек (по данни на [16]). Оцветени са различните спрямо човека остатъци.

За лечение на диабетици са използвани масово както свински, така и говежди инсулин. При малък брой диабетици е установена начална алергична реакция спрямо инжектирания инсулин, тъй като тяхната имунна система разпознава чуждия инсулин. Голямата част от диабетиците обаче може да ползва свински или говежди инсулин без имунологични усложнения, тъй като променените остатъци са малко на брой и промените имат консервативен характер. (Консервативна е замяната на една аминокиселина с друга с близка полярност, напр. вал с иле).

Свинският инсулин се различава само по 30-ия остатък във верига В (вместо треонин има аланин) и затова към него има по-голяма поносимост, отколкото към говеждия инсулин. Последният се различава по два остатъка А8 и В30, като и на двете места вместо треонин има аланин. Въпреки че треонин има хидроксилна група, той има и метилова група, поради което относителната хидрофобност на треонин и аланин са близки. Затова се смята, че замяната на треонин с аланин е консервативна. Посочените промени в свински и говежди инсулини не променят значително пространствената организация на инсулина.

Понастоящем човешки инсулин може да се получи в бактерии чрез рекомбинантна ДНК технология или чрез химическа модификация на свински инсулин.

2.5.5. Роля на гликозилиран хемоглобин HbA за контролиране на захарен диабет

При високи концентрации на кръвна глюкоза хемоглобинът се гликозилира неензимно в крайни и лизинови амино-групи. Чрез йонообменна хроматография фракцията на гликозилирания хемоглобин, означавана като HbA, се определя на около 5 % в здрав човек. Тя нараства пропорционално с повишение на кръвната глюкоза. Тъй като животът на еритроцитите е около 120 дни, концентрацията на HbA дава информация за средната концентрация на кръвната глюкоза през предшестващите 2-3 месеца. Това позволява да се контролира състоянието на диабетно болни пациенти чрез диета и лечение с подходящи дози инсулин до нормализиране на кръвната глюкоза.

2.5.6. Неправилно зреене на колаген при недостиг на витамин С причинява скорбут

Колагенът е най-застъпеният белтък в тялото (вж т. 2.3.4.).

Дефекти в синтезата на колаген могат да доведат до неправилна функция на сърдечно-съдовата система, на костите (крехкост и лесна чупливост), на кожата (трудно заздравяване на рани и прекалена разтегливост), на ставите (свръхподвижност или артрити) и на очите (дислокация на лещите). Заболявания възникват поради дефекти в гените за колаген, при неправилна посттранслационна модификация на колагена или при недостиг на кофакторите за ензимите, които осъществяват тази посттранслационна модификация на колагена. По-долу е разгледано заболяването скорбут.

       Фиг. 2-25. Участие на аскорбат (витамин С) при хидроксилирането на пролин и лизин в процеса на зреене на колаген.

Скорбутът не е генетично заболяване. Характеризира се с кървящи венци, подкожни кръвоизливи, трудно зарастване на рани. Скорбут се развива при недостиг в храната на витамин С (аскорбинова киселина), който е необходим кофактор за ензимите пролилхидроксилаза и лизил хидроксилаза. Както самото име подсказва, тези ензими от ендоплазмения ретикулум катализират ковалентно модифициране на пептидно-включени пролин и лизин - хидроксилират ги до хидроксипролин и хидроксилизин, съответно (фиг.2-25). Приетите с храната хидроксипролин и хидроксилизин не се използват за биосинтеза на колаген поради липса на съответни тРНК. Тези ензими не хидроксилират свободни аминокиселини, а само вече включените в полипептидна верига.

Липсата на хидроксипролин и хидроксилизин не позволява стабилизирането на тройната колагенова суперспирала чрез напречни ковалентни връзки между трите вериги.

2.5.7. Сърповидноклетъчна анемия - доказателство за детерминиращата роля на първичната структура спрямо по-висшите структури

Както бе многократно изтъкнато, първичната структура детерминира по-висшите структури на белтъчната молекула и нейните свойства и функции. За нейното първостепенно значение говори примерът с HbS, който се отличава от нормалния HbА само по един аминокиселинен остатък в b-веригите.

Структурата на тетрамерния хемоглобин А (a2b2) е разгледана в т. 2.2.6 и 2.3.2 и 2.3.3). Вместо глутамат (полярен) на 6 място в b-веригите на HbS има валин (хидрофобен). Тази замяна води до образуване на "лепкав изпъкнал участък" на повърхността на b-веригата, както в окси-, така и в дезокси-HbS. Такъв "лепкав участък" няма в HbA, тъй като на 6 позиция там има полярен глутамат и при среща молекулите не се слепват, а остават в разтвор. На повърхността на дезокси-HbS има и друг, комплементарен на "лепкавия участък" - "вдлъбване". Когато HbS е в дезокси-състояние "лепкавият изпъкнал участък" от една молекула се свързва с "вдлъбнатината" от друга молекула. И тъй като има две b-вериги във всяка молекула, образуват се дълги линейни полимери от HbS (фиг. 2-26). Така, като следствие от промяната в първичната структура, разтворимостта на дезокси-HbS е 25 пъти по-ниска от тази на дезокси-HbА. При снижено налягане на кислород, дезокси- HbS се утаява. Промененият сумарен заряд на HbS (един минус по-малко) променя и електрофоретичната му подвижност спрямо HbА (фиг. 2-27).


Фиг. 2-26. Полимеризиране на HbS във фиброзни структури. Замяната на полярния глутамат в HbА с хидрофобен валин в HbS променя конформацията и физикохимичните свойства на белтъчната молекула, улеснява полимеризирането и утаяването на HbS и води до лизис на еритроцита.
о - "лепкав изпъкнал участък" в дезокси HbS;
Комплементарно на "лепкавия" участък е "вдлъбването" в HbS и HbА. Молекулите на дезокси-HbА не се слепват и остават в разтвор, а тези на HbS се слепват и утаяват.

Образуващата се фиброзна утайка от HbS уврежда клетъчните мембрани на еритроцити, съдържащи HbS. Разрушените клетки лизират и се развива хемолитична анемия. Особената сърповидна форма на еритроцитите допълнително допринася за развитието на кризата, тъй като се запушват малките кръвоносни съдове.

Мутацията в хемоглобин S е неконсервативна, тъй като полярният глутамат е заменен с хидрофобен валин.

     Фиг. 2-27. Различна електрофоретична подвижност на хемоглобин S спрямо хемоглобин А.
Вдясно - HbA от здрав човек; вляво - HbS от болен от сърповидноклетъчна анемия; в средата - HbА и HbS от носител на сърповидноклетъчна анемия.

2.5.8. Прионови болести

По съвсем нов, неизвестен доскоро механизъм възникват заразните прионови болести, предизвикващи спонгиформени енцефалопатии ("луда крава" по говедата, болест на Creutzfeldt-Jacob по човека и др.) [20-22]. Част от невроните дегенерират, тъй като в тях се отлагат неразтворими амилоидни фибрили, съдържащи патологични прионови белтъци (фиг. 2-28). Прионовите белтъци, които са открити в болни индивиди или животни, не са свързани с нуклеинови киселини, нито съдържат нуклеинови киселини.


Фиг. 2-28. Сравнение на физиологичен белтък PrP-sen (PrPc), чувствителен към действието на протеази и патологичен белтък PrP-res (PrPSc), нечувствителен към действието на протеази.

Физиологичният белтък се означава като PrРс или като PrP-sen, тъй като е чувствителен (sensitive) към протеази. Патологичният белтък се означава като PrPSc или като PrP-res, тъй като не се разгражда от протеази (резистентен към протеази). Считаше се, че прионовите белтъци са с еднаква първична структура като някои нормално срещащи се белтъци в мозъчна тъкан, но с променена вторична и третична структура. Stahl и Prusiner (1991) установиха, че промяната е резултат от пост-транслационна модификация, включваща отстраняване на секвенция от амино-края, използване на алтернативен карбоксилен край, и модификация на две N-свързани въглехидратни съставки.

Превръщането на нормалния белтък (с a-спирални участъци) в патологичен (с b-листове) става вероятно спорадично или под въздействие на друг белтък. Но полученият патологичен белтък катализира пренагъване на нормалния белтък и последващото му агрегиране.

2.6. Материали за самостоятелна работа

2.6.1. Примерни писмени задачи:

1. Напишете с формули част от полипептидна верига, съдържаща в посока от амино- към карбоксилния край двадесетте аминокиселини.
С помощта на фиг. 2-5 проверете дaли правилно сте написали скелета на полипептидната верига. Проверете и формулите на радикалите, които са дадени в т. 2.1.3.

2. Напишете заредените форми на свободните (в разтвор) аминокиселини глицин, лизин, хистидин, аргинин, глутамат, аспартат и цистеин при рН 7. Напишете пептида, образуван от същите аминокиселини, и изчислете сумарния му заряд Z при рН 1, рН 7 и рН 12.

Отговори:
Z = +4 при pH 1;
Z = +4 -3 = 1 при pH 7;
Z = -3 при pH 12

2.6.2. За да проиграете теста към този раздел, щракнете върху следващото заглавие-връзка:  "Състав, структура и функции на белтъци" в желан от Вас режим (последователно или случайно подреждане н авъпросите). Същия тест може да откриете като минете през Дисциплини / биохимия / Тестове / Демонстрационни тестове / Тест "Състав, структура и функции на белтъците".

2.6.3. За да решите клиничния случай Сандра, щракнете върху следващото заглавие-връзка: "Сандра"  . До същия случай можете да стигнете като минете през  Дисциплини / биохимия/  Симулации на клинични случаи / "Сандра".

2.6.4. Разгледайте анимациите на хемоглобин-мономер и хемоглобин-тетрамер, създадени от Prof. Andrew Booth, University of Leeds и любезно предоставени за ползване в катедра Биохимия на Медицински Университет-София.
Щом се появи картината, щракнете веднъж върху нея, за да задвижите анимацията.
Oxydeoxy.avi (Хемоглобин-мономер - преход от окси- в дезокси-състояние)

Tetramer.avi (Хемоглобин-тетрамер - преход от окси- в дезокси-състояние)

Анимациите могат да бъдат свалени върху Вашия компютър като щракнете върху съответната връзка с десен бутон и изберете "Save as target". Проиграват се с Windows Media Player.

2.6.5. Молекулна графика с компютърната програма RASMOL (RASWIN)

1. Свалете файла rasmol2.zip (като щракнете с десен бутон  върху връзката и изберете Save target as) и го разархивирайте в отделна папка. Отворете програмата Rasmol, любезно предоставена за нашия сайт от нейния автор Roger Sayle, Bioinformatics group, Metaphorics, Santa Fe, New Mexico , и я разучетe.

В папката има и примерни файлове. След разархивиране на zip-файла отворете програмата като щракнете два пъти върху файла Rw32b2a.exe. Ползвайки главното меню и допълнително отварящия се прозорец "RasMol Command Line", отворете файла 1hrc.pdb, съдържащ атомните координати на цитохром c и се опитайте да получите сами дадения на фиг. 2-29 молекулен образ на цитохром c.



Фиг. 2-29. Молекулно изображение на цитохром c, получено чрез програмата RasMol на Roger Sayle, ползвайки данните за атомните координати на цитохром c от Protein Data Bank [10].

Отговор
Ето какви са необходимите действия:
1. Отворете файла Rw32b2a.exe чрез двукратно щракване върху него. Отваря се главният прозорец на програмата с черен фон, а най-долу на екрана в лентата с отворени проpорци ще видите още един прозорец "RasMol Command Line", в който може да се задават допълнителни команди. Нагласете големината на двата прозореца така, че да ги виждате и двата на екрана едновременно.
2. В главния прозорец от File Open отворете файла 1hrc.pdb
Появява се молекулното изображение на цитохром c, тип Wireframe.
3. В главния прозорец от Display изберете Ribbons. Изображението се променя.
4. За да оцветите веригата в зелено, в прозореца "RasMol Command Line" напишете color green и натиснете бутона Enter.
5. За да визуализирате невидимия засега лиганд (хем), в прозореца "RasMol Command Line" напишете select ligand, натиснете бутона Enter и след това в главния прозорец от Display изберете Spacefill. Хемът се появява в зелен цвят.
6. За да оцветите хема в червен цвят, в прозореца "RasMol Command Line" напишете color red и натиснете бутона Enter.
7. За визуализиране електронната плътност около a-спиралните участъци в прозореца "RasMol Command Line" напишете select helix, натиснете бутона Enter, след това напишете dots on и натиснете бутона Enter.

По подобен начин чрез RASMOL може да отворите един по един файловете и да получите посочените по-долу или други изображения:
1) a-helix.ent, съдържащ атомните координати на a-спирала - виж фиг. 2-10 в т. 2.2.4.;
2) B-sheet.ent, съдържащ атомните координати на b-структура - виж фиг. 2-11 в т. 2.2.4.;
3) 1hrc.pdb, съдържащ атомните координати на белтъка цитохром с - виж фиг. 5-18 в т. 5.4.3.

След появата на молекулния образ на черен фон запишете последователно следните примерни команди в отворения команден прозорец. След всяка команда натискайте клавиша "Enter".
background white (черният фон ще стане бял)
select helix (маркират се a-спиралните участъци)
color red (a-спиралните участъци се оцветяват в червено)
select all (маркира се цялата молекула)
hbonds on (показва водородните връзки)
hbonds off (скрива водородните връзки)
select ligand (маркира се хемът)
color green (оцветява се хемът в зелено).

Тези и много други команди могат да бъдат зададени и в друга последователност. Опитайте сами. При необходимост ползвайте вградената в програмата помощ (Help).
Разгледайте под различен ъгъл различните модели (wireframe, backbone, sticks, balls and sticks, spacefill, ribbons, strands). Оцветете в различен цвят отделни аминокиселини, a-спирални и b-структурни участъци и водородни връзки.

2. Посетете домашната страница на програмата RASMOL http://www.umass.edu/microbio/rasmol/

3. Координати на други белтъци може да изтеглите от
PubMed - The National Library of Medicine's Search Service (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/). Ако Ви е трудно да изписвате този URL, може да ползвате търсещата машина Google (http://www.google.com) и да й зададете да открие pubmed. Тя ще го открие за секунди.

4. Посетете The Online Macromolecular Museum
и от Exhibits (експонати) разгледайте представените белтъчни структури.

2.7. Литература

1. Murray, R., Granner, D., Mayes, P., Rodwell, V. (2000) Harper's Biochemistry, Prentice-Hall International, Inc., Twenty-Fifth Edition.
2. Kyte, J., and Doolittle, R. F. J. Mol. Biol. 157, 1982, 105-132. A simple method for displaying the hydrophobic character of protein.
3. Николов, Т. Обща биохимия за биолози и биохимици, 1991, Наука и изкуство, София.
4. Brogdon, R. N. and Heel, R. C. Human insulin: a review of its biological activity, pharmacokinetics, and therapeutic use. Drugs 34: 350, 1987.
5. Bell, G.I., Swain, W.F., Pictet, R., Cordell, B., Goodman, H. M. and Rutter, W. J. (1979) Nature 282, 525.
6. PubMed - The National Library of Medicine's Search Service: http://www.ncbi.nlm.gov/Entrez/Medline.html
7. Sayle, R. http://www.metaphorics.com
8. The Online Macromolecular Museum:
http://www.clunet.edu/BioDev/omm/gallery.htm
9. Kavanaugh, J. S., Rogers, P. H., Case, D. A., Arnone, A. High-resolution X-ray study of deoxy hemoglobin Rothshield 37Beta Trp- -> Arg: A mutation that creates an intersubunit chloride binding site; PDB1hba.ent
10. Bernstein, F. C., Koetzle, T. F., Williams, G. J. B., Meyer, E. F. Jr., Brice, M. D., Rodgers, J. R., Kennard, O., Shimanouchi, T. & Tasumi, M (1977). J. Biol. Chem. 112, 535, Protein Data Bank. A computer-based archival file for the macromolecular structures, file Br568.
11. Henderson, R., Balduin, J. M., Ceska, T. A., Zemlin, F., Beckamn, E., Downing, K. H. (1990) J. Mol. Biol. 213, 899-929. Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high resolution electron cryomicroscopy.
12. http://www.clunet.edu/BioDev/omm/ig/molmast.htm
13. Birktoft, J. J., Blow, D. M. J. Mol. Biol. 68, 1972, 187. The structure of crystalline alpha-chymotrypsin.
14. Gamblin, S., Cooper, B., Millar, J., Davies, G., Littlechild, J., Watson, H. (1990) FEBS Lett 262: 282 -296. The crystal structure of human muscle aldolase at 3 A resolution.
15. Wang, D., Bode,W., Huber, R. J. Mol. Biol. 185, 1985, 595. Bovine chymotrypsinogen A. X-Ray Crystal Structure
16. Devlin, T. M. (ed.) (1997) Textbook of Biochemistry with Clincical Correlations, Wiley-Liss, New York, Fourth Edition.
17. Prockop, D. J. and K. I. Kivrrikko (1995) Ann. Rev. Biochem. 64, 403. Collagens: Molecular Biology, diseases, and potentials for therapy.
18. Davidson, V. L. and Sittman, D. B. (1999) Biochemistry, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Fourth editon.
19. Roskoski, R. (1996) Biochemistry, W. B. Saundres Company, First Edition.
20. Prusiner, S. B. Science, 278, 1997, 245. Prion diseases and the BSE crisis.
21. Serpell, L. C., Sunde, M., Blake, C. C. P. Cell Mol. Life Sci 53, 1997, 871. The molecular basis of amiloidosis.
22. Weber, T., Aguzzi, A. Intervirology, 40, 1997, 198. The spectrum of transmissible spongiform encephalopathies.

Структура и функции на нуклеинови киселини

Цели

Цели на преподавателя: Да се разгледа значението, съставът и структурата на нуклеиновите киселини и да се дадат примери за приложението на тези познания в медицината.

След работа с този раздел студентите ще могат да постигнат следните учебни цели:

А. Знания
1) да дадат дефиниция за нуклеинови киселини;
2) да дефинират що е нуклеозид и нуклеотид и да изброят съставните им части;
3) да дефинират термина "минорни бази" и да дадат примери за минорни пуринови и пиримидинови бази;
4) да дефинират що е цикличен нуклеотид;
5) да дадат примери за ролята на свободните нуклеотиди;
6) да посочат примери за аналози на пуриновите и пиримидиновите бази като антивирусни и антитуморни агенти;
7) да дефинират фосфодиестерната връзка между нуклеотидите в нуклеиновите киселини;
8) да дефинират какво е първична структура на НК;
9) да опишат особеностите и конформацията на ДНК и на различните видове РНК (иРНК, рРНК, тРНК, мяРНК);
10) да обяснят накратко какво представляват хромозоми, хроматин, нуклеозоми, рибозоми;

Б. Разбирания
1) да обяснят лактим-лактамната тавтомерия при базите и нейното значение;
2) да обяснят значението на минорните бази;
3) да разбират каква е връзката между базата и пентозата в нуклеозида и каква е връзката между пентозата и фосфорната киселина в нуклеотида;
4) да обяснят разликата между моно-, ди- и три-нуклеозидфосфатите;
5) да разбират и обяснят защо аналози на пуриновите и пиримидиновите бази служат като антивирусни и антитуморни агенти;
6) да разбират и обяснят особеностите на полинуклеотидните вериги;
7) да разбират и обяснят причините за вариации в конформацията на ДНК;
8) да обяснят биологичната роля на различните видове РНК;
9) да обяснят какво представляват генетичните болести;
10) да обяснят какво представлява хибиридизация;

В. Умения
1) да пишат формулите на пуриновите и пиримидинови нуклеозидмоно-, ди- и трифосфати, вкл. и на циклични нуклеотиди, напр. 3',5'-цикличен АМФ и 3',5'-цикличен ГМФ;
2) да представят първичната структура на нуклеинови киселини посредством структурни формули и съкратено;
3) да могат да сравняват първична структура на нуклеинови киселини с тази на белтъци;
4) да визуализират конформацията на нуклеинови киселини в различни модели посредством програмата RasMol;
5) да прилагат знанията от този раздел за разбиране механизма и/или възможностите за потискане на злокачествен растеж и инфекции;
6) да прилагат изучената теория, за да обяснят първопричината за някои генетични болести, напр. сърповидноклетъчна анемия и фенилкетонурия;
7) да осъществяват търсене по биохимичен термин в рамките на сайта или извън сайта.

3.1. Резюме

ДНК съхраняват и предават наследствената информация от поколение на поколение. Тази информация, презаписана в РНК, се използва за синтеза на белтъци, тРНК и рРНК. Нуклеиновите киселини са хетеробиополимери, изградени от нуклеотиди, свързани помежду си с 3',5'-фосфодиестерни връзки. Нуклеотидът е производна органична структура, която съдържа база (пуринова или пиримидинова), пентоза и фосфорна киселина. При свързване на базата с пентоза чрез N-гликозидна връзка се образува нуклеозид. Връзката между пентозата на нуклеозида и фосфорната киселина е естерна. ДНК съдържат дезоксирибоза, а РНК - рибоза. Пуриновите бази са аденин (А) и гуанин (Г). Пиримидиновите бази са урацил (У), цитозин (Ц) и тимин (Т). В ДНК участват А, Г, Ц и Т. В РНК участват А, Г, Ц и У. Като свободни съединения нуклеотидите имат важна роля в метаболизма.

ДНК са високомолекулни структури, изградени от две комплементарни и антипаралелни вериги. Моделът на Watson и Crick за двойната спирала на ДНК обяснява откритите от Чаргаф закономерности за равенство в концентрацията на А и Т и на Г и Ц. Дезоксирибозо-фосфатният скелет на веригите е от външната страна на спиралата, а базите от двете вериги са насочени едни към други и свързани с водородни връзки (две между А и Т и три между Г и Ц). Денатурация на ДНК е процес, при който при увеличаване на температурата, снижаване на йонната сила, или други причини, веригите се разделят. При бавно охлаждане е възможна ренатурация. По-издържливи на денатурация са ДНК, в които двойките Г-Ц преобладават над А-Т. Вследствие вариации в конформацията на нуклеотидите, ДНК може да бъде в Z-, В- и А-форма. При физиологични условия преобладава В-формата. В ДНК има специфични (около 75 %) и повтарящи се (около 25 % ) секвенции. Наличието на специфични мотиви (повтори) в ДНК може да е причина за вариации в конформацията като огъване, фуркетни и други форми, тройно- и четворноверижни участъци. Пакетирането на ДНК започва от нуклеозомите, минава през нишки с диаметър 10 и 30 nm и през други по-висши структури достига до митотичните хромозоми или интерфазния хроматин.

Разгледани са и характерните особености в структурата на иРНК, рРНК, тРНК, необходими за осъществяване на тяхната функция при реализиране на генетичната информация, както и структурата на малката и голямата субединица на рибозомите.

Структурни аналози на бази или техни производни имат приложение за потискане на туморен растеж или микробиални инфекции.

3.2. Определение, видове и биологична роля

Нуклеиновите киселини са хетеробиополимери с изключителна биологична роля, отразена в т.н. централна догма на молекулната биология, формулирана от Франсис Крик (фиг. 3-1).

Фиг. 3-1. "Централна догма", формулирана от Ф. Крик за ролята на нуклеиновите киселини за съхраняване и предаване на наследствената информация.

1- репликация на ДНК, 2 - транскрипция на ДНК; 3 - транслация на информацията; 4 - обратна транскрипция.

Дезоксирибонуклеиновите киселини (ДНК) съхраняват и предават наследствената информация от едно поколение на друго, а освен това определят свойствата на живата клетка чрез регулиране експресията на генетичната информация, главно чрез упражняване на контрол върху синтезата на рибонуклеинови киселини (РНК) и белтъци.

Синтезата на нова идентична ДНК или предаването на наследствената информация от едно поколение на друго (процес 1 на схемата) се означава като репликация на ДНК. Презаписването или транскрипцията на информацията (процес 2) представлява синтеза на РНК. Превеждането или транслацията на информацията (процес 3) предствлява синтеза на белтъци. В някои вируси е възможен и обратен поток на информацията от РНК към ДНК (процес 4) -обратна транскрипция.

Различните видове РНК участват в белтъчната биосинтеза, някои от тях действат като катализатори. В някои вируси РНК, а не ДНК, са носители на генетичната информация - напр. ретровируси. Такъв е вирусът, причиняващ СПИН (HIV). Обмяната и функциите на нуклеиновите киселини са разгледани в глави 12-15.

3.3.-3.3.1. Състав на нуклеиновите киселини. Структура на нуклеотидите. Пуринови и пиримидинови бази

За разлика от белтъците, които са изградени от основни органични структури (аминокиселини), нуклеиновите киселини са изградени от нуклеотиди, които са производни органични структури.

Нуклеотидът е изграден от азотна база, пентоза и фосфорна киселина.

На фиг. 3-2 са представени главните азотни бази в нуклеиновите киселини: две пуринови - аденин (А) и гуанин (Г) и три пиримидинови - цитозин (Ц), урацил (У) и тимин (Т). Номерацията на атомите в пуриновия пръстен е, както следва: в 6-атомния пръстен е обратно на часовниковата стрелка, а в 5-атомния пръстен по часовниковата стрелка. Номерацията в пиримидиновия пръстен е по часовниковата стрелка.

Фиг. 3-2. Пуринови и пиримидинови азотни бази в нуклеиновите киселини.

Освен главните бази, в нуклеиновите киселини има в значително по-малки количества и други - т. н. минорни бази (фиг. 3-3). Тези бази са химически модифицирани (метилирани и други) производни на главните бази. Те имат важно физиологично значение - служат за разпознаване на олигонуклеотиди, за регулиране полуживота на РНК, а също и за разпознаване на "свои" от "чужди" бази, т.е. в някои случаи метилирането има защитна функция - метилираните бази се възприемат от ДНК-разграждащи ензими (рестриктази) като свои. Разграждат се само неметилирани (чужди) бази. Метилирането в нуклеиновите киселини не е случайно, то се извършва в определени участъци под действие на специални ензими. По-често се метилират А и Ц, отколкото Г и Т. В състава на секвенцията 5'-ГАТ-3' А може да бъде метилиран и това е индикация за вярна/стара верига при поправяне на грешки при репликация на ДНК. В еукариоти около 5 % от Ц е метилиран, най-вече в ЦГ секвенции. Често степента на метилираните ГЦ участъци е обратно пропорционална на степента на генна експресия.

Съществуват и бази, които не участват в състава на нуклеиновите киселини, но имат значение в или за организма (фиг. 3-4). При разграждане на нуклеотиди се получават базите хипоксантин и ксантин, които се окисляват до крайния продукт пикочна киселина. В кафето, чая и какаото се съдържат базите кофеин, теофилин, теобромин.

Фиг. 3-3. Примери за минорни бази в РНК (7-метилгуанин, хипоксантин, 4-тио-урацил, псевдоурацил) и в ДНК (N6-метиладенин, N2-метилгуанин, 5-метилцитозин и 5-хидроксиметилцитозин. Псевдоурацил е идентичен с урацил, но в нуклеозида псевдоуридин (вж т.3.3.4) за свързване с пентозата участва не N1, а C5.

Фиг. 3-4. Примери за бази, които не участват в състава на нуклеиновите киселини, но имат значение в или за организма.

3.3.2. Тавтомерия при базите

При наличие на кето (оксо) и амино-заместители в ароматните ядра на пурини и пиримидини се наблюдава лактам-лактимна (кето-енолна) и амино-имино тавтомерия, както е представено на фиг. 3-5. При физиологични условия преобладават лактамните и амино-формите. Докато в пуриновите бази при N9 има циклична група независимо в коя форма са, то при пиримидиновите циклична имино-група при N1 има само в предпочетените тавтомери. А тези атоми са важни за свързване с пентозата.

Фиг. 3-5. Амино-имино и лактам-лактимна (кето-енолна) тавтомерия при пурини и пиримидини. При физиологични условия преобладават амино-формите и лактамните форми.

3.3.3. Син и анти-конформери при рибо- и дезоксирибонуклеозиди

При свързване на база и пентоза се получава нуклеозид. Атомите в пентозата се номерират с примове ('). Връзката между базата и пентозата е b-N-гликозидна. На фиг. 3-6 са дадени един пуринов нуклеозид (аденозин) и един пиримидинов нуклеозид (уридин).

Фиг. 3-6. Пуринов нуклеозид (аденозин) и пиримидинов нуклеозид (уридин).
N-гликозидната връзка в нуклеозидите се получава при обезводняване на цикличната NH-група при N9 в пуриновата база (или N1 в пиримидиновата база) и гликозидната НО-група при С1'-атом в пентозата.

N-гликозидната връзка в пуриновите нуклеотиди се получава при обезводняване на NH-група при N9 в базата и гликозидната НО-група при С1'-атом в пентозата. При пиримидиновите нуклеозиди връзката е между N1 в базата и С1'-атом в пентозата. Пуриновите нуклеозиди имат окончание -озин (аденозин, гуанозин), а пиримидиновите имат окончание -идин (уридин, тимидин, цитидин).

Нуклеозидите могат да съществуват в две конформационни форми (син и анти). Преобладават анти-конформерите. На фиг. 3-7 са дадени двете конформационни форми на аденозин.

Фиг. 3-7. Аденозин в конформация син и анти.

3.3.4. Нуклеотиди - номенклатура, заряд, спектри

При свързване на нуклеозид с фосфорна киселина се получава нуклеотид. На фиг. 3-8 са дадени рибонуклеотидът АМФ и дезоксирибонуклеотидът дЦМФ. Връзката между пентозата и киселината е естерна. В рибонуклеозидите има три възможни позиции за фосфорилиране: при С2'-, С3'- и С5'-атоми. В дезоксирибонуклеозидите има две възможни позиции за фосфорилиране: при С3'- и С5' атоми.

Фиг. 3-8. Структура на рибонуклеотида аденозин-5'-монофосфат (АМФ) и дезоксирибонуклеотида дезоксицитидин-5'-монофосфат (дЦМФ).

В природата преобладават нуклеозид-5'-фосфатите. В съкратеното название на нуклеотидите, напр. АМФ, буквата А вече означава не базата аденин, а нуклеозида аденозин. Ако не е указана позицията на фосфатната група, АМФ означава аденозин-5'-фосфат. Малката буква "д" пред съкращението на нуклеотида се чете "дезокси" и означава, че пентозата е дезоксирибоза, напр. дЦТФ (дезоксицитидин-5'-монофосфат).

Освен нуклеозид-монофосфати, съществат и нуклеозиддифосфати (АДФ, ГДФ, ЦДФ и пр), и нуклеозидтрифосфати (АТФ, ГТФ, ТТФ и пр.- вж фиг. 3-9), чиято биологична роля е разгледана накратко в т. 3.3.5 и в гл. 5.

Фиг. 3-9. Структура на аденозинмонофосфат (АМФ), аденозиндифосфат (АДФ) и аденозинтрифосфат (АТФ).

Трите фосфатни остатъка са означени с гръцките букви a, b и g. Връзката между пентозата и a-остатъка е естерна, а връзките между a-b и b-g остатъците са киселинно-анхидридни (макроергични или богати на енергия и затова са представени със символа ~ - вж гл. 5).

На фиг. 3-10 е представен цикличният нуклеотид 3',5'-АМФ (цАМФ), който, както и 3',5'-ГМФ (цГМФ), действа като вторичен посредник при предаване на хормонални сигнали (вж гл. 17).

Фиг. 3-10. Структура на цикличен 3',5'-АМФ (цАМФ).

Нуклеозидите не са заредени, но в мононуклеотидите рКa-стойностите на двете кисели групи на фосфатния остатък са около 1.0 и 6.2. Затова при физиологично рН мононуклеотидите са заредени отрицателно.

Характерните спектри на пуриновите и пиримидиновите бази и на всички техни производни имат максимум на поглъщане при 260 nm в ултравиолетовата област. Те се използват за доказване и за определяне на нуклеотиди и нуклеинови киселини. Спектрите са рН-зависими. Поглъщането при 260 nm обяснява мутагенното действие на ултравиолетовата светлина.

Пуриновите и пиримидиновите бази лесно се разделят чрез различни техники: хартиена и йонообменна хроматография, електрофореза. С HPLC-хроматография лесно се разделят и определят дори наномоларни количества от базите.

3.3.5. Роля на нуклеотидите

Нуклеотидите са градивните единици на нуклеиновите киселини.

Освен това като свободни нуклеотиди те имат съществени функции:

1) Нуклеозид-дифосфатите и нуклеозид-трифосфатите са с висок потенциал на групов пренос (съдържат киселинно-анхидридни фосфатни връзки, които са макроергични или богати на енергия връзки - вж глава 5). Донатори са на енергия за осигуряване на многобройни биосинтези и други ендергонични процеси.

2) Участие в метаболизма, например:
  - уридиловите нуклеотиди са необходими за обмяна на въглехидрати;
  - цитидиловите нуклеотиди са необходими за обмяна на фосфолипиди;
  - гуаниловите са необходими за белтъчна биосинтеза и глюконеогенеза.

3) Участват в състава на по-сложни коензими, чиито формули са дадени в глава 5. Тези коензими са никотинамидаденин динуклеотид (НАД окислен и редуциран), никотинамидаденин динуклеотидфосфат (НАДФ окислен и редуциран), флавинадениндинуклеотид (ФАД окислен и редуциран) и коензим А (КоА).

4) Имат регулаторен ефект, напр. съотношението АДФ/АТФ регулира скоростта на окисление в митохондрийната дихателна верига.

5) Някои нуклеотиди действат като алостерични ефектори (инхибитори или активатори) върху различни ензимни активности.

6) Цикличните нуклеотиди цАМФ и цГМФ участват в трансдукцията или препредаването на хормонални сигнали, а също и като активатори на транскрипция на някои гени.

3.4. Първична структура на нуклеиновите киселини

Първичната структура на нуклеиновите киселини се определя от последователността на нуклеотидите в полинуклеотидната верига. Първичната структура определя биологичните свойства на нуклеиновите киселини. В полинуклеотидните вериги нуклеотидите са свързани помежду си чрез ковалентни 3', 5'-фосфодиестерни връзки (фиг. 3-11).

Фиг. 3-11. Полинуклеотидни вериги в ДНК и РНК. Нуклеотидите са свързани чрез 3', 5'-фосфодиестерни връзки.

Полинуклеотидните вериги в еукариоти са отворени вериги с два различни края, линейни, неразклонени. Разнообразието в различните вериги се дължи на различното редуване на базите. Скелетът на всяка полинуклеотидна верига е еднакъв поради монотонно редуване на фосфатни и пентозни остатъци, свързани чрез 3'-,5'-фосфодиестерни връзки. Веригите са полярни (имат 2 различни края: 5'-край и 3'-край). В прокариоти нуклеиновите киселини могат да бъдат линейни или кръгови.

ДНК се отличават от РНК по молекулна маса, по пентозата, по пиримидиновите бази, по локализация в клетката и по функциите. Пентозата в ДНК е 2'-дезоксирибоза, а в РНК е рибоза. Цитозин, аденин и гуанин участват в ДНК и РНК. Като се изключат упоменатите в т. 3.3.1. минорни бази, като главна база урацил участва само в РНК, а тимин само в ДНК.

3.5.-3.5.1. Особености и конформация на ДНК. Размери и локализация на ДНК в клетката

Единствената хромозома на E.coli съдържа една двойно-верижна кръгова молекула на ДНК, съдържаща 4 х 106 двойки бази. Във висшите организми ДНК от различни тъкани на един и същи индивид е една и съща. Хаплоидният геном на всяка човешка клетка съдържа 3 х 109 двойки бази и е разделен в 23 хромозоми. Дължината на ДНК от 46-те хромозоми на соматична клетка от човек в опънато състояние би била около 2 м.

Около 99 % от ДНК в еукариоти се намира в ядрата на клетките. Ядрената ДНК в еукариоти е свързана с белтъци, образуващи комплекс, наречен хроматин, който се наблюдава през интерфазата или хромозоми по време на митозата (вж т. 3.5.8).

ДНК (около 1 % ) има и в митохондриите. Човешките митохондрии съдържат 2 до 10 копия от нискомолекулна двойно-верижна циклична ДНК.

3.5.2. Модел на Watson и Crick

Появата на модела на Watson и Crick е обусловена от следните важни предпоставки:

1) Изследвайки два вида щамове на пневмококи: капсулирани (S-щам) и некапсулирани (R-щам), O. Eйвъри и сътр. показаха, че именно ДНК, а не друг компонент на капсулираните S-щамове, е носител на наследствената информация и трансформира некапсулираните R-щамове в S-щамове.

2) Изследванията на Е. Чаргаф показаха, че моларните съотношения аденин/тимин и гуанин/цитозин в ДНК са равни на единица.

Обобщавайки наличната информация и вземайки предвид рентгено-структурните изследвания на М. Уилкинс и Р. Франклин върху структурата на ДНК, Watson и Crick представиха своя модел за ядрената ДНК като линейна двуверижна молекула - двойна спирала (фиг. 3-12-I).

Фиг. 3-12-I. Модел на Watson и Crick за двойно-спиралната структура на ДНК.
Ширината на дясно-въртящата двойна спирала е 2.0 nm, а ходът на спиралата е 3.4 nm. В един ход на спиралата има 10.5 нуклеотидни двойки. Дебелата вертикална линия представлява централната ос на спиралата. Веригите са антипаралелни и комплементарни.
А - аденин, Г - гуанин,
Ц - цитозин, Т - тимин,
Ф - фосфатен остатък,
Д - дезоксирибозен остатък.
(По-късно е установено, че този модел съвпада с В-формата на ДНК - вж т. 3.5.4).

Дезоксирибозо-фосфатните скелети на двете вериги са от външната страна на спиралата, а базите от двете вериги са насочени едни срещу други във вътрешността на спиралата. Оформят се две различни бразди (вдлъбнатини) - малка и голяма, в които специфични белтъци взаимодействат с ДНК.

Две от киселинните групи на всеки фосфатен остатък са ангажирани в 3',5'-фосфодиестерните връзки, а третата киселинна група е свободна и дисоциира протон при физиологично рН. Затова всяка ДНК спирала има отрицателни заряди по повърхността.

На фиг. 3-12-II са дадени изображения на В-ДНК чрез програмата RasWin.

Фиг. 3-12-II. Изображения на част от В-ДНК с програмата RasWin [1].
1, 2 и 3 - поглед отгоре,
4 и 5 - фронтален изглед.
1 и 4 - модел тип Wireframe, 2 - модел тип Backbone,
3 и 5 - модел Sticks.

По отношение на репликацията всяка от веригите на ДНК служи като матрица за изграждане на новосинтезираща се верига.

По отношение на транскрипцията само една от веригите служи като матрица за биосинтеза на РНК върху даден ген и се означава като матрична. В някои участъци на ДНК едната верига служи като матрична, а в други участъци другата верига служи като матрична, т.е. генетична информация за синтеза на РНК се ползва и от двете вериги. Комплементарната на матрицата верига се нарича кодираща и има идентична секвенция на базите с РНК, получаваща се при транскрипция, но вместо Т, в РНК има У.

На фона на изискването за максимална стабилност на двойната спирала, интересно е, че общият размер точно на двойката бази А-Т и Г-Ц е равен на диаметъра на двойната спирала. Различни фактори в двойната спирала на ДНК налагат ограничения и позволяват образуването на две водородни връзки между А и Т и три водородни връзки между Г и Ц (фиг. 3-13). От значение най-вече са:

1) предпочитаната анти-конфигурация на N-гликозидната връзка в нуклеотидите;
2) преобладаване на амино- и лактамните тавтомерни форми на базите.

Това обяснява защо комплементарни бази в двойната спирала на ДНК са именно аденин-тимин и гуанин-цитозин. Водородните връзки до голяма степен определят стабилността на двойната спирала.

Фиг. 3-13. Водородни връзки между комплементарните бази в двойната спирала на ДНК според Watson и Crick.

Във всяка от веригите базите, разположени в плоскости една над друга, взаимодействат помежду си чрез хидрофобни взаимодействия и чрез p-взаимодействия, което, в добавка към водородните връзки между двете вериги, също стабилизира двойната спирала.

Освен комплементарни, веригите в двойната спирала са и антипаралелни: едната верига върви в посока 5'-3', а другата в обратна посока 3'-5'.

В отсъствие на фосфодиестерази, фосфодиестерните връзки в ДНК са стабилни и изолирана ДНК може да се съхранява дълго време.

3.5.3. Денатурация и ренатурация на ДНК

Денатурацията на ДНК е процес, при който при увеличение на температурата, при снижаване солевата концентрация на разтвора, а също и в алкална среда, се разкъсват водородните връзки между базите и двете вериги се разделят. Нарушават се също и p-взаимодействията между базите във всяка верига и те остават съединени във веригата само чрез фосфодиестерните връзки. Денатурацията може да се проследи по увеличеното поглъщане на УВ светлина при 260 nm (хиперхромен ефект) или по намалението на вискозитета на разтвора. Кривата, отразяваща процента на денатурация от температурата, се нарича крива на топене (фиг. 3-14). Температурата, при която се достига 50 % денатурация, се означава като температура на прехода (Тm).

Фиг. 3-14. Крива за денатурация на ДНК в зависимост от температурата.
 Тm - температура на прехода.

Денатурацията на изолирана ДНК дава сведения за относителния брой на двойките Г-Ц и А-Т. ДНК е по-устойчива на денатурация, ако съдържа повече двойки Г-Ц. Колкото е по-голям броят на двойки Г-Ц в ДНК, толкова е по-висока температурата на топене на ДНК.

Ренатурация, или обратното свързване на комплементарни, разделени при денатурация вериги, може да се извърши, ако температурата се понижи бавно. Ренатурацията е бавен процес, който зависи от срещата на комплементарни ДНК вериги.

Хибридизация се нарича специфичната реасоциация на комплементарни вериги от различен произход (напр. от различни ДНК-молекули или от ДНК и от РНК, или от различни РНК-молекули). Като експериментална техника позволява да се установяват хомологии между ДНК на различни видове (вж гл.16).

3.5.4. Конформационни форми на ДНК вследствие вариации в конформацията на нуклеотидите

Поради вариации в конформацията на нуклеотидите, двойната спирала на ДНК е гъвкава структура, която може да съществува в няколко различаващи се форми (В, А, Z). Най-стабилна и преобладаваща при физиологични условия е форма В и моделът на Watson и Crick съвпада с тази форма. А-формата, която се образува при ниска влажност в лабораторията, прилича на В-формата, също е дясно-въртяща спирала, но е по-компактна (вместо 10 има 11 бази на един оборот). Z-ДНК е ляво-въртяща спирала. Тя може да присъства в клетката като малки участъци от общата ДНК, които съдържат редуващи се пуринови и пиримидинови нуклеотиди, включени между дълги участъци от В-ДНК. В Z-ДНК скелетът има зигзагообразен ход, а не спирален, както е в В-ДНК. И в трите форми на ДНК веригите са комплементарни и антипаралелни.

В т. 3.12 ще намерите Web-връзки към сайт с молекулни изображения на трите форми на ДНК.

3.5.5. Специфични и повтарящи се последователности в ДНК

Ориентировъчните проценти за специфичните и повтарящи се последователности в човешката ДНК са дадени в табл. 3-1.

Табл. 3-1. Специфични и повтарящи се последователности в човешка ДНК.

 Последователности в ДНК
%
Общо:
100
 1. Специфични
75
 2. Повтори
          2.1. Пръснати
          2.2. Струпани
25
15
10

Повтарящите се последователности се наричат за по-кратко повтори. Повторите с висока честота са около 1 до 10 млн копия за хаплоиден геном. Те са транскрипционно неактивни и имат структурна роля в хромозомите. Струпани са в теломерите и центромерите на хромозомите.
Повторите с умерена честота са до 1 млн копия за хаплоиден геном. Към тях спадат известните като SINEs (short intespersed nuclear elements) и LINEs (long intespersed nuclear elements) секвенции в ДНК, всяка около 5 % от общата ДНК.
Човешката ДНК съдържа много секвенции (2-6 bp), повтарящи се тандемно различен брой пъти (до 50 пъти) в определени локуси от генома на различни индивиди. Тези локуси се наричат хипервариабилни, защото съдържат вариращ брой тандемни повтори. Английското съкращение VNTR идва от variable number of tandem repeats. Най-често се срещат динуклеотидните повтори АЦ в едната верига и ТГ в другата верига - в 50 000 до 100 000 места в генома. Има и други повтори ЦГ, АТ, ЦА. Във всеки локус броят на повторите може да варира за двете хромозоми, водещо до хетерозиготност по отношение броят на копията. Този признак е наследствен и може да се използва за установяване на родство или извършители на криминални престъпления (виж т. 16.7.4).

3.5.6. Вариации в конформацията на ДНК, причинени от специфични повтарящи се мотиви в секвенцията на ДНК

Наличието на специфични мотиви в некодиращата секвенция на ДНК, означавани като dos-ДНК (dos - defined ordered structures, или структури с дефиниран порядък) може да е причина за вариации в конформацията на ДНК като огъване, образуване на фуркетни и кръстовидни форми, тройно- и четворноверижни участъци. Тези мотиви включват симетрични елементи като обратни повтори, огледални повтори, прави повтори (вж табл. 3-2), а също и хомопуринови и хомопиримидинови секвенции, поли-А участъци и участъци, богати на Г.

Табл. 3-2. Видове повтори в ДНК.

Секвенция в ДНК
Вид на повтора
5'   -Г -Г-Ц-Ц-    3'
3'    -Ц-Ц-Г- Г-    5'
палиндром
(напълно симетричен обратен повтор)
5'    -Т-Т-А-Г-Ц-А-Ц- Ц-А-Ц-Г-А-Т-Т-    3'
3'   -А-А-Т-Ц- Г-Т- Г- Г -Т- Г-Ц-Т-А-А-   5'
огледален повтор
 
5'    -Т-Т-А- Г-Ц-А-Ц- Т-Т-А-Г-Ц-А-Ц-    3'
3'    -А-А-Т-Ц- Г-Т- Г-А-А-Т-Ц-Г-Т- Г-    5'
прав повтор
(могат и да са отдалечени)

Секвенциите в изброените повтори са самокомплементарни и могат да образуват фуркетни форми в едната верига (фиг. 3-15 вляво) или кръстовидни форми в двете вериги (фиг. 3-15 вдясно).

Фиг. 3-15. Образуване на фуркетни форми в една верига (вляво) и на кръстовидни форми в две вериги (вдясно) при вътрешноверижно комплементарно взаимодействие между базите от представените последователности.

Освен водородни връзки по Watson-Crick, между базите в ДНК могат да се образуват и така наречените водородни връзки по Hoogsteen (фиг. 3-16), които позволяват образуване на тройноспирални участъци в ДНК. Тези водородни връзки по Hoogsteen възникват между две полипуринови и една полипиримидинова верига, напр. Г-Г-Ц или А-А-Т, а също и между две полипиримидинови вериги и една полипуринова верига, напр. Т-А-Т или Ц-Г-Ц.

Фиг. 3-16. Водородни връзки между базите по Hoogsteen.

На фиг. 3-17 е представен тройно-верижен участък на ДНК (наричан Н-ДНК). Тройноверижни участъци от ДНК се разполагат в некодиращата част на генома и имат значение за генната регулация. Те могат да упражняват контрол върху репликацията и транскрипцията, да усилват стабилността на теломерите и да повлияват инициацията на генетична рекомбинация.

Фиг. 3-17. Тройно-верижен участък в ДНК, наричан Н-ДНК.

Известни са и четворно-верижни участъци в ДНК (фиг. 3-17a). В теломерите може да се образува четворноверижна ДНК от паралелен или антипаралелен тип. Структури от паралелен тип се образуват по време на рекомбинация на ДНК, напр. в гените за тежката верига на имуноглобулини. Предпоставка за това е наличието на повтори с високо съдържание на Г. Водородните връзки между отделните вериги са от типа на Hoogsteen.

     Фиг. 3-17а. Кватернерни структури в ДНК:

Вляво - Част от кватернерна структура (четворноверижен участък) в ДНК;

Вдясно - Взаимодействие между четири гуанинови бази в кватернерната структура чрез водородни връзки по Hoogsteen.

От изложеното се вижда, че ДНК не е изпъната, стабилна, монотонна и униформена структура. Обратно, ДНК образува необичайни кръстовидни структури,тройно-верижни или дори четворно-верижни участъци. При взаимодействие с хромозомни белтъци, ДНК също променя конформацията си. Тези промени в конформацията са важни за процесите на молекулно разпознаване на ДНК от ензимни и неензимнибелтъци.

3.5.7. Суперспирализиране на ДНК

Суперспирализиране на ДНК възниква при огъване или извиване оста на двойната спирала на ДНК. Среща се в различна степен както при малки кръгови ДНК в прокариоти (фиг. 3-18), така и при линейните ДНК в еукариоти. Суперспирализираната структура е напрегната за разлика от релаксираната.

Суперспирализирането е важно за постигане по-голяма компактност на ДНК (вж т. 3.5.8.) Освен това то настъпва при разтваряне на веригите при репликация (гл. 12) и транскрипция на ДНК (гл. 13). Суперспирализирането не е случаен, а регулиран процес във всяка клетка.

Фиг. 3-18. Суперспирализиране на ДНК в прокариоти.
1 - релаксирано състояние;
2 - суперспирализирано състояние.

3.5.8.-3.5.8.1. Пакетиране на ДНК. Роля на хистоновите белтъци за пакетиране на ДНК в нуклеозоми

Ако ДНК в човешка клетка се изпъне, нейната дължина би била около 2 м. А диаметърът на ядрото, в което ДНК е пакетирана, е 0.006 mm.

ДНК в човешки клетки е свързана с белтъци в съотношение 1:2. Белтъците са три групи:  хистонови белтъци, нехистонови хромозомни белтъци и ензимни белтъци, участващи в репликацията (глава 12) и транскрипцията (глава 13).

Хистоните са консервативни белтъци, което подчертава важната им функция в еукариоти. Масата на хистоните е приблизителна равна на тази на ДНК. Има пет вида хистони: Н1, Н2А, H2B, Н3 и Н4. Те улесняват пакетирането на ДНК в по-малък обем, като се свързват с ДНК и изграждат по-компактни структури, наречени нуклеозоми. Организацията на нуклеозомите е представена на фиг. 3-19-2. Пакетирането на нуклеозомите в по-висши структури е описано в т. 3.5.8.2. За удобство фиг. 3-19 е представена в т. 3.5.8.1. и 3.5.8.2.

Фиг. 3-19. Пакетиране на ДНК в структури от по-висш порядък.
1 - ДНК;
2a - нуклеозома (Около октамер от хистони, съдържащ по два от хистони Н2А, Н2В, Н3 и Н4, е навита ДНК (1.75 оборота);
2b - хроматозома - (към нуклеозомата е прикрепен хистон Н1 (в зелен цвят);
3 - нишка от нуклеозоми с диаметър 10 nm (по-компактна от В-ДНК 7 пъти);
4 - нишка с диаметър 30 nm (по-компактна от В-ДНК 40 пъти);
5 - структура с диаметър 300 nm (получава се чрез допълнително нагъване на нишки с диаметър 30 nm (в кафяво) и прикрепването им към скелета на митотична хромозома (в черно);
6 - част от интерфазна хромозома (по-компактна от В-ДНК около 8 000 и повече пъти), диаметър 700 nm. Получава се при допълнително огъване на скелета заедно с прикрепените към него нишки от ДНК).

В нуклеозомата октамер от хистони, съдържащ по два от хистоните Н2А, H2B, Н3 и Н4, формира белтъчна сърцевина, около която е навита ДНК (1.75. оборота от ДНК-спиралата). Хистоните Н2А и Н2В са богати на лизин, а Н3 и Н4 са богати на аргинин. При физиологично рН лизиновите и аргининовите остатъци са заредени положително и биха могли да участват в неспецифични електростатични взаимодействия с отрицателно заредените фосфатни остатъци от ДНК. За да се избегне това и да се направлява правилното образуване на нуклеозомите е важен т.н. белтък нуклеоплазмин [5]. Той е кисел пентамерен ядрен белтък, който не се свързва нито с хистоните, нито с ДНК. Предполага се, че той осигурява в ядрото йонно обкръжение, подходящо за специфично свързване между хистоните и ДНК.

В нуклеозомата 146 двойки бази от ДНК са защитени от нуклеази и са недостъпни за транскрипция. Нуклеозомите са разделени една от друга с къси участъци свързваща ДНК. Присъединяването на хистон Н1 към нуклеозомата води до получаване на т.н. хроматозома (фиг. 3-19-2). Н1 е най-лабилно свързан към ДНК и отделянето му чрез солева екстракция превръща хроматина в разтворим.

3.5.8.2. Пакетиране на нуклеозомите в митотични хромозоми

Предполага се, че взаимодействието на Н1 със съседни нуклеозоми е от значение за по-нататъшно пакетиране на ДНК в структури от по-висок порядък. Нуклеозомите се пакетират в нишки с диаметър 10 nm, наподобяващи под електронен микроскоп наниз от мъниста (фиг. 3-19-3 ). Така организираната ДНК е около 7 пъти по-компактна структура от В-ДНК. По-нататъшното пакетиране на тези 10-nm нишки в розетка от шест нуклеозоми води до получаване на влакна с диаметър 30 nm (фиг. 3-19-4), наречени соленоиди. В тях ДНК е около 40 пъти по-компактна от В-ДНК.

Фиг. 3-19. Пакетиране на ДНК в структури от по-висш порядък.
1 - ДНК;
2a - нуклеозома (Около октамер от хистони, съдържащ по два от хистони Н2А, Н2В, Н3 и Н4, е навита ДНК (1.75 оборота);
2b - хроматозома - (към нуклеозомата е прикрепен хистон Н1 (в зелен цвят);
3 - нишка от нуклеозоми с диаметър 10 nm (по-компактна от В-ДНК 7 пъти);
4 - нишка с диаметър 30 nm (по-компактна от В-ДНК 40 пъти);
5 - структура с диаметър 300 nm (получава се чрез допълнително нагъване на нишки с диаметър 30 nm (в кафяво) и прикрепването им към скелета на митотична хромозома (в черно);
6 - част от интерфазна хромозома (по-компактна от В-ДНК около 8 000 и повече пъти), диаметър 700 nm. Получава се при допълнително огъване на скелета заедно с прикрепените към него нишки от ДНК).

Не е добре изяснено как соленоидите се пакетират до митотични хромозоми, където дължината на молекулата на ДНК се скъсява спрямо В-ДНК около 8 000 -10 000 пъти. Предполага се, че ДНК образува извивки (бримки), всяка съдържаща около 100 000 нуклеотидни двойки. В соматичните клетки на човека по време на митозата, когато клетките са в процес на делене, хроматинът се пакетира в ясно видими отделни структури, наречени хромозоми, които по време на митозата са видими под светлинен микроскоп. Всяка хромозома съдържа два идентични хроматиди, свързани в т.н. центромер (фиг. 3-20-I). Краищата на хромозомите се наричат теломери. Центромерът разделя хромозомата на два сегмента р (къс) и q (дълъг).

          Фиг. 3-20. Организация на ДНК в хромозоми по време на митоза.
1 - Хромозома в началния стадий на митоза;

Двата хроматида са представени с червен и син цвят.

2 - Набор от хромозоми на нормален мъж (46ХУ).

Соматичните клетки на човека съдържат 46 хромозоми или 23 двойки, от които 22 са еднакви в мъже и жени и се наричат автозомни хромозоми. Последната двойка (полови хромозоми) се означава като ХХ при жените и ХY при мъжете. Автозомните хромозоми се номерират от 1 до 22 по намаляващ размер (1 е на-голямата и 22 е най-малката хромозома) (фиг. 3-20-II).

Местоположението на гените се означава с числа след буквите p или q. Напр. генът, означен като 15q23-q24, е разположен в дългия сегмент на 15 хромозома ( цифрата 2 означава главната ивица, а числата 3 и 4 - подивици на ивица 2).

3.5.8.3. Интерфазен хроматин

По време на интерфазата, когато ДНК трябва да е достъпна за ензимите на репликацията и транскрипцията, тя е пакетирана по-слабо в структура, наречена хроматин. Известно е, че цялата ДНК не е пакетирана в еднаква степен. В повечето клетки се наблюдават поне три форми на пакетация на ДНК:

1) Хетерохроматин. Той представлява най-плътно пакетираната ДНК, така както е в митотичната хромозомна форма. Тук спадат около 90 % от ДНК, която е транскрипционно неактивна, свързана в нуклеозоми и нечувствителна към действието на нуклеази.

2) Еухроматин. В него степента на пакетиране е много по-слабо изразена. Тук спадат останалите 10 % от ДНК, която съдържа около 100 000 гена. Информацията на тези гени може да се презаписва, т.е се използва за биосинтеза на белтъци и РНК.

3) Домени с извивки (бримки). Има доказателства, че ДНК е прикрепена към матрикс с белтъчна природа: скелет в митотичните хромозоми и ядрен матрикс в интерфазното ядро. Извивки от ДНК се протягат навън от този матрикс, като се смята, че в тях има активни гени.

3.5.8.4. Структурни мотиви в нехистоновите хромозомни белтъци

Нехистоновите хромозомни белтъци имат структурна и регулаторна функция, а към тях принадлежи и целият ензимен набор за репликация и транскрипция на ДНК (вж глава 12 и 13). За целта особено важно е специфичното им свързване с ДНК.

В структурата на хромозомните белтъци има характерни мотиви като a-спирала-свивка- a-спирала, цинков пръст и левцинов цип (фиг. 3-21), които осигуряват специфично свързване на регулаторните белтъци с определен район от ДНК.

Мотивът a-спирала-свивка- a-спирала е първият и най-добре изучен мотив в хромозомните белтъци. Пример за такъв мотив има в димерния белтък "cro-репресор" (фиг. 3-21-1). Един от спиралните участъци в този мотив разпознава специфично място от 20 bp в голямата бразда на ДНК [2].


1 2
3 4

Фиг. 3-21. Структура на домeни в хромозомни белтъци: 1 - домени, съдържащи a-спирала-свивка- a-спирала, 2 - цинков пръст; 3 и 4 - левцинов цип.

В мотива цинков пръст (фиг. 3-21-2) има серия от повтарящи се домени (от 2 до 9), в които по протежение на веригата Zn атом взаимодейства с общо 4 цистеинови и хистидинови остатъци [3]. Цинковите пръсти взаимодействат с 5 bp в голямата бразда на ДНК. Важността на този мотив за взаимодействието на стероидните хормони с ДНК личи от примера с единична мутация в който и да е от двата цинкови пръсти на рецептора за калцитриол. Такава мутация води до резистентност в действието на хормона и до клиничния синдром рахит.

При мотива "левцинов цип" (фиг. 3-21-3 и 4), открит в карбоксилния край на хромозомни белтъци, в последователност от около 30 остатъци има a-спирална структура, в която всеки седми остатък е левцин. Това позволява взаимодействие на тези левцинови остатъци с такива от друга подобна a-спирална структура, така че се получава "левцинов цип" [4, 5].

3.6. Роля и конформация на иРНК

Информационните РНК (иРНК), наричани по-рано матрични РНК, пренасят информацията за синтеза на белтъци от ДНК в ядрото към специални органели в цитоплазмата, наречени рибозоми, където се извършва белтъчната биосинтеза.

иРНК служи като матрица при белтъчната биосинтеза. Тя е комплементарна на матричната верига на ДНК и идентична с първичната структура на кодиращата верига в ДНК с тази разлика, че вместо Т, съдържа У и има различни нива на структуриране от ДНК. При свързването на няколко рибозоми с иРНК се получават полизоми.

За всички иРНК са характерни следните особености:
В 5'-края на иРНК има нестандартни нуклеотиди като напр. 7-метилгуанозинтрифосфат и 2'-О-метилрибонуклеотид и други. Този край се означава като шапка (фиг. 3-22). Шапката вероятно е необходима, за да бъде разпозната иРНК от апарата за белтъчна синтеза. Веднага след шапката следва т.н. лидерна секвенция, която не се превежда. След нея започва секвенция, която се превежда. Тя започва с иницииращия кодон АУГ и завършва с терминиращ кодон (УАГ или УАА или УГА). След терминиращия кодон е разположена т.н. поли-А-опашка в 3'-края на иРНК, която представлява полимер от аденилатни остатъци (20-250 на брой). "Шапката" и "опашката" защитават иРНК от действието на специфични екзонуклеази.

В прокариотите иРНК са полицистронни, т.е. носят информация за повече от една полипептидна верига. В еукариоти иРНК са моноцистронни, т.е. съдържат информация само за една полипептидна верига. Тъй като информацията е заложена в линейната структура на иРНК, нейната цялост е от особено значение. Всяка промяна в секвенцията, напр. загуба или промяна в нуклеотидите, може да промени белтъка, който се синтезира при превеждане на генетичната информация.

Фиг. 3-22. Структура на участъка, наричан "шапка", прикрепен към 5'-края на иРНК.

Информационните рибонуклеинови киселини се синтезират в ядрото във вид на прекурсорни молекули, които са много хетерогенни по размер. Те са с по-високи молекулни маси от тези на зрелите иРНК. Съдържат екзони (кодиращи последователности) и интрони (некодиращи последователности). Синтезата и зреенето на иРНК са описани в глава 13.

3.7. Конформация на рРНК. Рибозоми

Рибозомните РНК (рРНК) са важни за белтъчната биосинтеза, защото заедно с белтъци изграждат рибозомите. Свързвайки иРНК и тРНК към рибозомите, те правят възможна транслацията на наследствената информация.

Рибозомните РНК са в преобладаващо количество в клетката в сравнение с останалите РНК. Те са метаболитно стабилни поради свързване с рибозомните белтъци и действат в продължение на много транслационни цикли. Метилирани са във висока степен. В пространствената им структура се редуват двойноспирални и едноверижни участъци. В двойноспиралните участъци, наречени фуркетни форми, взаимодействията между базите от различни участъци на веригата са комплементарни и антипаралелни.

Голямата субединица на рибозоми (60S) от бозайници се изгражда от 5S РНК, 28S РНК и 5.8S РНК и приблизително равно количество белтъци. В малката субединица на рибозоми (40S) от бозайници се съдържа 18S рРНК и белтъци. На фиг. 3-23 са представени голямата и малката субединици на рибозомите.

Фиг. 3-23. Структура на рибозоми

1 - голяма субединица; 2 - малка субединица; 3 - комплекс от малка и голяма субединица.

3.8. Структура на тРНК

В тРНК има повече минорни бази, отколкото в останалите РНК. Това увеличава специфичността на тРНК и улеснява разделянето им.

При огъване на тРНК се оформят четири двойноспирални сегменти (поради комплементарност на базите) и три едноверижни бримки. Това е т.н. модел за вторична структура на тРНК, наречен "детелинов лист" (фиг. 3-24).

Във всяка тРНК има четири важни участъци:
1) акцепторен участък (тройка нуклеотиди ЦЦА в 3'-края), където се свързва определена аминокиселина;
2) псевдоуридилова бримка (Т- y-Ц) - за свързване с 5.8S рРНК от рибозомите.
3) антикодонна бримка, съдържаща специфичен триплет от нуклеотиди, наречен антикодон, тъй като е комплементарен и антипаралелен на определен кодон в иРНК;
4) дихидроуридилова бримка (D). Тя се свързва с 28S рРНК от 60S рибозомната субединица.

Първите два участъка са еднакви при всички тРНК. Последните два са специфични за всяка тРНК.

Освен споменатите три бримки, има и една допълнителна бримка, условно наричана мини-бримка или вариабилна бримка с дължина от 3-5 до 13-21 бази. Чрез тази бримка в тРНК се осигурява едно и също разстояние между аминокиселинния и антикодонния участъци в тРНК.

Фиг. 3-24. Вторична структура на тРНК за фенил-аланин - модел "детелинов лист".

1 - акцепторен участък (ЦЦА), свързващ аминокиселината;

2 - псевдоуридилова бримка за свързване с 5.8 S рРНК от 60S рибозомната субединица;

3 - вариабилна бримка;

4 - участък, съдържащ антикодон, комплементарен на съответен кодон в иРНК;

5 - дихидроуридинова бримка за свързване с 28S рРНК от 60S рибозомната субединица.

Пространственото огъване на тРНК (третична структура) е показано на фиг. 3-25. Псевдоуридиловата и дихидроуридиловата бримки са близко разположени, така че цялата молекула добива L-образна компактна конформация. Образуват се не само водородни връзки по Watson-Crick, но и между повече от два нуклеотида, както и между пентозо-фосфатния скелет и някои бази. 2'-ОН група на рибозата е важен донатор и акцептор на водород при образуване на водородни връзки.

Фиг. 3-25. L-образна третична структура на тРНК, която се получава при огъване на структурата "детелинов лист" в пространството.

3.9. РНК в рибонуклеопротеинови частици

РНК, освен като носители на генетична информация, може да имат и каталитични функции. Малки стабилни видове РНК се срещат в ядрото, цитоплазмата и митохондриите. Функционират съвместно с една или повече белтъчни субединици в рамките на рибонуклеопротеинови частици.
В еукариотното ядро има много копия на високо консервативни нискомолекулни РНК, наречени малки ядрени РНК (мяРНК или на английски snRNA). По състав са стабилни. Повечето от тях са под форма на рибонуклеопротеини, наречени snurps (small nuclear ribonucleoproteins) и означавани съкратено U1, U2 и т.н. В 5’-края на U1 има последователност, частично комплементарна на мястото между екзони и интрони в първичните иРНК-транскрипти (гл. 13). U1 и останалите "snurps" са необходими за процеса на зреене на иРНК, т.е. действат като рибозими - вж т. 3.10.
Тази информация показва, че има вероятност т. нар. модел “РНК свят” да е бил възможен. Според този модел най-ранните живи организми на Земята са били основани изцяло върху РНК, а ДНК и белтъците са се появили по-късно в еволюцията [6].
Известно е също така, че много вируси, вкл. и по човека, използват генетичната информация в РНК. Някои от тези РНК имат каталитични функции и така предоставят възможност за създаване на РНК-базирани лекарствени препарати. Могат да се получат синтетични рибозими, които специфично да разпознават и разграждат клетъчни иРНК. При опити в клетъчни култури такива рибозими ефикасно прекратяват генната експресия.

3.10. Рибозими

Освен белтъчните катализатори, на които е посветена гл. 4, известно е, че и някои РНК имат каталитична функция. Те катализират транс-естерификация и хидролиза на фосфо-диестерни връзки в РНК молекули.

Тези РНК, за които са характерни присъщите за биологичните катализатори каталитична активност и висока специфичност по отношение на субстрата, се наричат рибозими.

Някои от тях (U1, U2, U4-U6, U5-snurps - т. 3.9) катализират отстраняването на интрони и съединяването на екзони при зреенето на иРНК (вж гл. 13).

Друг пример представляват 28S рРНК в еукариоти и 23S рРНК в прокариоти, действащи в белтъчната биосинтеза като рибозим с пептидилтрансферазна активност (гл. 14).

РНК с каталитична активност има и в състава на ензима теломераза (гл. 12).

3.11.-3. 11.1. Приложение на познанията върху нуклеинови киселини в клиничната практика: пуринови и пиримидинови аналози като антиракови и антивирусни агенти

Голям брой синтетични аналози на естествените бази, нуклеозиди и нуклеотиди потискат злокачествен растеж и инфекции като или инхибират ензими, които са важни за синтезата на нуклеиновите киселини, или изместват естествените нуклеотиди в нуклеиновите киселини и с това значимо променят взаимодействията между базите. На фиг. 3-26 са дадени формулите на 6-меркаптопурин (пуринов аналог) и на 5-флуорурацил (пиримидинов аналог).

6-Меркаптопурин (6-МП) е полезен антитуморен агент при хора. В туморните клетки той се превръща в 6-меркаптопурин рибонуклеотид, който се натрупва в клетките и инхибира синтезата на пурини. Добавянето на алопуринол, инхибитор на ензима, който разгражда 6-МП, забавя неговото разграждане и усилва антитуморните свойства на 6-МП. По-подробно механизмът на действието на 6-МП е разгледан в глава 9.

Фиг. 3-26. Примери за синтетични пиримидинови и пуринови аналози с клинично приложение: 5-флуорурацил и 6-меркаптопурин.

5-флуорурацил сам по себе си не е активен агент. Но той се превръща от клетъчните ензими до активните метаболити 5-флуоруридин-5'-трифосфат (F-УТФ) и 5-флуор-2'-дезоксиуридин-5'-фосфат (F-дУМФ). F-УТФ се включва в РНК и инхибира превръщането на прекурсорна рРНК в зрелите 28S рРНК и 18S рРНК. Освен това променя превръщането на прекурсорни иРНК в зрели иРНК.

F-дУМФ е мощен и специфичен инхибитор на ензима, който синтезира тимин, тъй като се свързва необратимо към него. Това води до необразуване на ТМФ и смърт на клетката поради липса на тимин.

По-подробно механизмът на действието на F-УТФ и F-дУМФ е разгледан в глава 9.

3.11.2. Генетични болести. Примери: сърповидно-клетъчна анемия и фенилкетонурия

Генетичните (или наследствени, генетично-обусловени) болести са заболявания, при които клиничните симптоми са свързани с промени в ДНК. Промените могат да бъдат твърде различни: от точкови мутации до хромозомни увреждания. Поради това генетичните болести се разделят на четири групи: моногенни дефекти (напр. сърповидно-клетъчна анемия), мултифакторно-зависими заболявания вследствие на полигенни дефекти и фактори на околната среда (напр. захарен диабет), хромозомни увреждания (напр. синдром на Dawn), митохондрийни болести. Допълнителна група са ненаследяващи се от поколението генетични дефекти в соматични клетки, като много видове рак.

При мутациите в единични гени се синтезира дефектен ензимен или структурен белтък с променена структура и активност, водещо до заболявания. Те могат да бъдат автозомални доминантни (напр. фамилна хипехорестеролемия) и автозомални рецесивни - напр. фенилкетонурия и сърповидно-клетъчна анемия, разгледани съответно в т. 2.5.3 и т. 2.5.7 от друга гледна точка.

Тук е важно да разберем, че първопричината за всяко от тези заболявания е промяната в гена, кодиращ съответния белтък. Промяната в гена за фенилаланинхидроксилаза при фенилкетонурия и в гена за HbS при сърповидно-клетъчната анемия води до белтъци с променена структура. Това от своя страна води до отклонения във функциите и заболяване.

3.12. Насоки за самостоятелна работа

3.12.1. Примерни писмени задачи:

1. Напишете с формули част от полинуклеотидна верига, съдържаща в посока от 5'- към 3'- края четирите нуклеотида, характерни за РНК. Напишете и част от верига на ДНК с характерните за нея нуклеотиди.
С помощта на фиг. 3-2 и 3-11 проверете дaли правилно сте написали скелета на полинуклеотидните вериги, нуклеотидите и връзките (N-гликозидни, естерни и фосфодиестерни).

3.12.2. Проиграйте теста: "Нуклеинови киселини" в желан от Вас режим.

3.12.3. Молекулна графика с компютърната програма RASMOL (RASWIN)

1. Свалете файла rasmol3.zip като щракнете върху връзката с десен бутон и изберете "Save target as". Разархивирайте го в отделна папка.  Отворете програмата Rasmol, любезно предоставена за нашия сайт от нейния автор Roger Sayle, Bioinformatics group, Metaphorics, Santa Fe, New Mexico , и я разучетe.

С програмата RasMol отворете файла bdna.ent, съдържащ атомните координати на част от В-ДНК.

Маркирайте с различен цвят двете вериги, базите, водородните връзки между базите. Разгледайте молекулата под различен ъгъл и я представете с различните модели: Wireframe, Sticks, Ball and Sticks, Spacefull, Ribbons.

3.12.4. Посетете Web-site: http://www.ornl.gov/TechResources/Human_Genome/home.html (http://www.ornl.gov/TechResources/Human_Genome/home.html), в който има информация за проекта за разшифроване на човешкия геном.

Ако някоя от връзките не работи поради промяна, извикайте търсачката Google (http://www.google.com) и напишете ключовите думи - напр. human genome project.

3.13. Литература

1. Sayle, R., BioMolecular Structures Group of Glaxo Research & Development, UK,
RASWIN molecular graphics program, 1994.
2. Mondragon, A. and S. C. Harrison. J. Mol. Biol. 219, 1991, 321. The phage 434 Cro/Or1 complex at 2.5 A resolution. PDB Id 3CRO, MMDB [3010].
3. C.K. Liew, K.Kowalski, A.H.Fox, A.Newton, B.K.Sharpe, M. Crossley & J.P.Mackay. Solution Structure Of The Ninth Zinc-Finger Domain Of The U- Shaped Transcription Factor. PDB Id.:1FU9, derived from ASN1.
4. Marti. D. N., I. Jelesarov and H. R. Bosshard. Nmr solution structure of a designed heterodimeric leucine zipper, PDB Id. 1FMH.
5. PDB Id.: IGD2 Leucine zipper
6. Kinniburg, A. J. Nucleic Acids Res. 17, 1989, 7771. A cis-acting transcription element of the c-myc gene can assume a H-DNA conformation
7. Pei, D., Corey, D. R. and Schulz, P. G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1990, 9858. Site specific cleavage of duplex DNA by a semisynthetic nuclease via triple-helix formation.

Ензими

Цели

Цели на преподавателя: Да се характеризират ензимите като биокатализатори, да се опишат възможностите за тяхната регулация и да се покаже ползата от тези познания за клиничната практика.

След работа с този раздел студентите ще могат да постигнат следните учебни цели:

А. Знания
1. да дадат определение за ензими, значение и видове;
2. да дадат определение за простетични групи и коензими и да дадат конкретни примери;
3. да опишат принципите за ензимната класификация и номенклатура и да ги подкрепят с конкретни примери;
4. да дадат определение за активен център;
5. да опишат как скоростта на ензимната реакция зависи от субстратната концентрация при ензими, подчиняващи се на Михаелис-Ментенова кинетика (да познават двете форми на уравнението на Михаелис-Ментен);
6. да дефинират кинетичните параметри на ензимната реакция Кm и Vmax и как се определят чрез уравнението на Lineweaver-Burk;
7. да опишат как рН и температурата влияят на скоростта на ензимната реакция;
8. да опишат как ефектори (инхибитори и активатори) повлияват скоростта на ензимната реакция;
9. да изброят единиците за ензимна активност;

Б. Разбирания
1. да обяснят приликите и разликите на ензимите с останалите катализатори;
2. да обяснят механизма на ензимно-катализираните реакции;
3. да обяснят ролята на витамините;
4. да разбират ролята на активния център и на останалата част от ензимната молекула;
5. да обяснят реакционната и субстратната специфичност на ензимите;
6. да обяснят защо зависимостта на скоростта на ензимните реакции от субстратната концентрация е хипербола, а не права линия както при химичните реакции;
7. да обяснят значението на Кm и Vmax;
8. да обяснят хода на кривата за зависимостта на скоростта на ензимната реакция от рН и температурата;
9. да обяснят разликите между конкурентни и неконкурентни инхибитори;
10. да обяснят основните харастеристики на алостеричното повлияване;
11. да обяснят основните харастеристики на фосфорилирането-дефосфорилирането и да дадат конкретен пример;

В. Умения
1. да прилагат знанията си върху нуклеотиди и витамини, за да представят с формули никотинамидни и флавинови коензими;
2. да могат при зададена реакция да определят главната група на ензима, катализиращ реакцията;
3. при зададена стойност на Кm да могат да преценяват какво е сродството между ензима и субстрата;
4. да анализират уравнението на Михаелис-Ментен и да изведат дефиниция за Кm;
5. да приложат познанията върху алостерично повлияване, за да обяснят оротатемия и подагра при някои пациенти;
6. да приложат познанията върху рН зависимостта на ензимната активност и върху Кm, за да обяснят повишена чувствителност към алкохол в някои пациенти с променени активности на алкохолдехидрогеназа и ацеталдехиддехидрогеназа;
7. да прилагат познанията си върху ензими за решаване на клинични случаи с инфаркт на миокарда - диагностика и терапия;
8. да прилагат познанията си върху ензими за разбиране механизма на различни генетично обусловени ензимопатии (оротатурия, фенилкетонурия, раазлични случаи на подагра, синдром на Lesh-Nihan);
9. да илюстрират принципа на метода Еlisa.

4.1.- 4.1.1. Обща характеристика на ензимите: резюме

Разбирането и възможностите за повлияване на всеки жизнен процес в норма и патология е немислимо без познаване на учението за ензимите.

Ензимите са биологични катализатори, за които са валидни всички общи свойства на катализаторите. Отличават се от тях по изключително високата си ефективност, специфичност (субстратна и реакционна) и възможността за регулация на активността и синтезата им.

Ензимите са високоспециализирани белтъчни молекули, които биват еднокомпонентни (съдържащи само белтъчна част) и двукомпонентни (съдържащи белтъчна и небелтъчна част ). Ако връзката между двете съставни части е слаба, небелтъчната част се нарича коензим, ако връзката между двете части е здрава, ковалентна - небелтъчната част се определя като простетична група. Ролята на коензими и простетични групи се изпълнява от витамини или техни производни, от някои метални йони, фосфатни остатъци и др. От химична гледна точка част от коензимите са нуклеотиди, напр. АТФ. Някои от нуклеотидните коензими са едновременно и производни на витамини, напр. НАД, ФАД и др.

Броят на ензимите, участващи в осъществяване на метаболизма на клетката надвишава 3000. Те са разпределени в шест главни групи: І.Оксидоредуктази; ІІ. Трансферази; ІІІ. Хидролази, ІV. Лиази, V. Изомерази, VІ. Синтетази. Ензимното име има две части: напр. сукцинат дехидрогеназа. Първата част дава името на субстрата, а втората посочва типа на катализираната реакция. Всеки ензим има кодов номер, състоящ се от четири цифри. Първата дава типа на реакцията (главната група); втората и третата цифри дават допълнителна информация за характера и механизма на реакцията (определят подгрупата и подподгрупата). Четвъртата цифра е индивидуалният номер на ензима.

Активният център е малка част по повърхността на ензимната молекула, където се свързва субстратът, за да се превърне в продукт. В еднокомпонентните ензими активният център се състои от няколко отдалечени по протежение на веригата аминокиселинни остатъци, които са близко в пространството поради формираната третична структура на белтъчната молекула. От функционална гледна точка различните химични групи в активния център се определят като каталитични и контактни. В двукомпонентните ензими за формиране на активния център групи предоставя и небелтъчната съставка. Тя предлага най-често каталитични групи, оставяйки за апоензима контактната функция.

Специфичността, реакционна и субстратна, е едно от най-съществените свойства на ензимите. Реакционната специфичност се определя от възможностите на групите в активния център да образуват или разграждат определен тип химични връзки. Субстратната специфичност се обяснява с високите стерични изисквания на активния център спрямо субстрата, произтичащи от определена ензимна конформация. Има различни модели за обяснение на субстратната специфичност: 1) на Фишер (абсолютно структурно и геометрично съответствие между активния център и субстрата) , валиден за малък брой абсолютно специфични ензими; и 2) на Кошланд (индуцирано структурно притъкмяване плюс субстратно напрежение), валиден за повечето ензими. Стереоспецифичността се обяснява с множествено свързване на субстрата към активния център.

4.1.2 Значение на ензимите

Учението за ензимите е основа на нашите познания върху всеки жизнен процес в норма и патология. Всеки физиологичен процес протича благодарение на каталитичното действие на определени ензими. Много заболявания непосредствено възникват от нарушения в ензимната катализа. Определянето на ензимни активности в кръв и други биологични течности дава ценни сведения за медицинската диагностика. Ензими се използват и за терапия при някои заболявания, напр. инфаркт на миокарда.

Поради това изучаването на особеностите на ензимите и на катализираните от тях реакции е рационален и съвременен подход в медицината.

4.1.3 Определение и общи свойства на ензимите като катализатори

Ензимите са биокатализатори, ускоряващи определени химични реакции в клетката. Болшинството от ензимите са белтъци, предимно глобуларни. Отскоро се знае, че малка част от РНК, наречени рибозими (виж глава 3), също действат като биокатализатори. Тази глава е посветена на ензимите с белтъчна природа.

За ензимите са валидни всички общи свойства на катализаторите:
1) Увеличават скоростта на спонтанно протичащи реакции, без да изместват химичното равновесие.
2) Променят в еднаква степен скоростта на правата и на обратната реакция до достигане на химично равновесие.
3) Действуват в незначителни количества.
4) Понижават активиращата енергия на реакцията.

Ензимите, както и другите катализатори, снижават активиращата енергия, защото провеждат реакцията по друг път с по-ниски енергетични изисквания. Характерно е образуването на междинно съединение между изходното вещество (т.н. субстрат) и ензима, което се нарича ензим-субстратен комплекс. Възможно е да се образуват няколко междинни съединения. Независимо колко са междинните фази, активиращата им енергия е винаги по-ниска от тази за некатализираната реакция.

4.1.4 Разлики между ензимите и останалите катализатори

Ензимите са високо специализирани белтъчни молекули. Отличават се от останалите катализатори по следните показатели:

1) Ензимите имат изключително висока ефективност - те ускоряват скоростта от 109 до 1012 пъти. Като пример е дадена реакцията на разграждане на Н2О2 до вода и кислород. (вж табл. 4-1).

Табл. 4-1. Ефективност на ензимното действие. Сравнение на ензима каталаза с други катализатори [1].

Катализатор
Активираща енергия*
(kJ/mol)
Увеличение на реакционната скорост
Без катализатор
75
1
Йодид
58
8.102
Колоидна платина
50
2.104
Каталаза
8
3.1011

*Активираща енергия е количеството енергия, необходима за преминаване на всички молекули от едно вещество в активирано състояние. Енергетичната бариера на реакцията е разликата между активиращата енергия и средната енергия.

2) Въпреки че като общ клас съединения ензимите са катализатори с изключително широк спектър на действие и на практика катализират всички известни реакции в организмите, отделният ензим проявява висока специфичност по отношение природата на реакцията и структурата на субстрата.

3) Действат обикновено при по-меки условия - атмосферно налягане, рН около неутралното, невисока температура.

4) Активността и синтезата на ензимите в клетките строго се регулират.

4.1.5 Коензими и простетични групи

Освен еднокомпонентни, има и двукомпонентни ензими, които съдържат белтъчна съставка (апоензим) и небелтъчна съставка. Апоензимът е термолабилен, високомолекулен и не диализира през полупропускливи мембрани. Небелтъчната съставка е термостабилно, нискомолекулно вещество, което диализира през полупропускливи мембрани. Двукомпонентният ензим се означава като холоензим. В зависимост от дисоциацията на холоензима до апоензим и небелтъчна съставка, дисоциационната константа К има различни стойности (4.1.1). При ниски стойности на К преобладава холоензимът, т.е. връзката между апоензима и небелтъчната съставка е здрава и небелтъчната съставка се нарича простетична група. Ако връзката с апоензима. е слаба, небелтъчната съставка се нарича коензим.

 

Като коензими или простетични групи функционират витамини или техни производни (витамините се синтезират в растенията и постъпват в организма на животните и човека с храната). Напр. витамин Н или биотин (фиг. 4-1-1) е простетична група на карбоксилази, свързана към апоензима с ковалентна връзка. Пиридоксалфосфат и пиридоксаминфосфат, близки производни на витамин В6 (пиридоксол), са коензим на трансаминази (фиг. 4-1-2-2). Метални йони и фосфатни остатъци често действат като простетични групи.

Фиг. 4-1. Примери за коензими и простетични групи.

1 - витамин Н (биотин) - простетична група на карбоксилази;
2 - витамин В6 (пиридоксол), пиридоксал и активните производни пиридоксалфосфат и пиридоксаминфосфат, коензими на трансаминази.

От химична гледна точка част от коензимите са нуклеотиди - напр. АТФ е преносител на фосфатна група и енергия. Други нуклеотидни коензими (фиг. 4-2) са едновременно и производни на витамини - напр. никотинамидаденин динуклеотид (НАД) , пренасящ водород, е динуклеотид, който съдържа аденилов нуклеотид и друг нуклеотид с никотинамидна база. Последната е всъщност витамин РР. Подобен е случаят и с други Н-пренасящи коензими като флавинмононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД). ФМН и ФАД съдържат базата рибофлавин (витамин В2).


Фиг. 4-2. Примери за нуклеотиди, съдържащи витамини и изпълняващи ролята на коензими.
А - никотинамидадениндинуклеотид (НАД) и никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ);
Б - флавинмононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД).

В зависимост от своята функция небелтъчните съставки се разделят на четири групи - вж табл. 4-2. Таблицата е почти изчерпателна, а от това ще заключим, че броят на коензимите не е много голям. Едни и същи коензими оперират с много ензими - напр. НАД+ е коензим на стотици дехидрогенази. Някои коензими участват в различни от химична гледна точка процеси - напр. пиридоксалфосфат взема участие както при трансаминиране, така и при декарбоксилиране на аминокиселини.

Табл. 4-2. Функции на коензимите и простетичните групи и връзки с витамините [2].

Коензим (простетична група) и функция
Съкраще-
ние
Име на съдържащия се
витамин
I. Пренасящи водород    
1. никотинамидадениндинуклеотид
НАД
РР (никотинамид)
2. никотинамидадениндинуклеотидфосфат
НАДФ
РР (никотинамид)
3. флавинмононуклеотид
ФМН
В2 (рибофлавин)
4. флавинадениндинуклеотид
ФАД
В2 (рибофлавин)
5. убихинон
УХ
-
6. липоева к-на (липоат)
ЛК
-
II. Пренасящи групи    
7. Аденозинтрифосфат - пренася фосфатна група или АМФ-остатък
АТФ
-
8. пиридоксалфосфат - пренася аминогрупа
ПФ
витамин В6 (пиридоксол)
9. уридиндифосфат - пренася гликозилни групи
УДФ
-
10. цитидиндифосфат- пренася фосфохолин
ЦДФ
-
11. аденозилметионин - пренася метилова група
-
-
12. тетрахидрофолат - пренася С1 групи
ФН4
фолиева киселина
13. биотин - пренася -СООН група
-
биотин (витамин Н)
14. Коензим А - пренася ацилни групи
КоА
пантотенова киселина
15. тиаминпирофосфат- пренася С2 групи
ТФФ
тиамин (витамин В1)
III. Коензими на изомерази и лиази    
16. уридиндифосфат - изомеризиране на въглехидрати
УДФ
-
17. пиридоксалфосфат - декарбоксилиране на аминокиселини
ПФ
пиридоксол (витамин В6)
18. тиаминпирофосфат - декарбоксилиране на алфа-кетокиселини
ТФФ
тиамин (витамин В1)
19. метилкобаламин - вътрешномолекулни премествания на групи
-
В12 (кобаламин)

4.1.6 Номенклатура и класификация на ензимите

Понастоящем са известни над 3000 ензима.
Международният съюз по биохимия и молекулярна биология (IUBMB) е възприел система за ензимна номенклатура, която позволява класификацията да бъде недвусмислена, трайна и всеки новооткрит ензим да намира мястото си в нея [3]. Характерни за класификацията са следните особености:
1) Реакциите и ензимите, които ги катализират, се разделят на 6 големи групи, всяка от които съдържа от 4 до 13 подгрупи.
2) Ензимното име има 2 части.
Например за ензима малат дехидрогеназа първата част съобщава името на субстрата (в случая малат) или субстратите. Втората част, окончаваща на -аза (в случая дехидрогеназа), посочва типа на катализираната реакция.
3) Всеки ензим има кодов номер, състоящ се от 4 числа. Първото дава типа на реакцията (главната група); второто определя подгрупата, третото - подподгрупата и четвъртото е индивидуалният номер на ензима.
Напр. кодовият номер ЕС. 1.9.3.1 определя цитохром с оксидазата:
1 - главна група - оксидоредуктаза;
9 - подгрупа 9 - отнема електрони от хемни групи като донатор;
3 - подподгрупа 3 - предава електрони на кислород като акцептор,
1 - цитохром с оксидаза - първи ензим в подподгрупа 3, окисляващ цитохром с
Съкращението ЕС идва от Enzyme Commission (Ензимна Комисия).

Заради яснотата и недвусмислеността си тази система е препоръчвана за употреба при научните изследвания [1]. В учебниците и в клиничната практика се допуска употреба на по-кратки названия на ензимите.

4.1.7 Кратка характеристика на шестте главни групи ензимно-катализирани реакции

I. Окислително-редукционни реакции
Ензимите се наричат оксидоредуктази. Те катализират окислително-редукционни реакции.
Под действие на дехидрогенази от различни субстрати се отделят 2 атома водород. Под действие на транселектронази се пренасят по 2 електрона. По-рядко в субстратите директно се внася кислород под действие на хидроксилази и оксигенази. По-долу е даден пример за сукцинат дехидрогеназа, която окислява сукцинат до фумарат (фиг. 4-3-I).

Фиг. 4-3-I. Пример за оксидоредуктаза.

II. Трансферазни реакции (прехвърляне на групи)
Ензимите са трансферази. Те катализират реакции на прехвърляне. Прехвърлят се разнообразни групи - съдържащи 1 въглероден атом (метилова, хидроксиметилова, формилова групи), ацилни радикали, гликозилни групи, амино-групи, фосфатни групи и др. По-долу е даден пример за фосфотрансферазата хексокиназа, която пренася фосфатна група от АТФ върху глюкоза (фиг. 4-3-II).

Фиг. 4-3-II. Пример за трансфераза.

III. Реакции на хидролиза
Ензимите са хидролази. В присъствие на вода те катализират реакции на хидролиза. Хидролизират се различни типове ковалентни връзки - естерни, киселинноамидни, пептидни, гликозидни, етерни, киселинно-анхидридни и др. По-долу е даден пример за хидролазата триацилглицерол липаза, която хидролизира триацилглицероли (мазнини) до глицерол и висши мастни киселини (фиг. 4-3-III).

Фиг. 4-3-III. Пример за хидролаза.

IV. Лиазни реакции
Ензимите са лиази. Те катализират процеси, при които една молекула се разгражда до две молекули, например декарбоксилаза (фиг. 4-3-IV-1). Често лиазните реакции са обратими - от две молекули се образува една нова - напр. виж присъединяване на вода към двойна връзка под действие на фумарат хидратаза (фиг. 4-3-IV-2). В една от подгрупите ензимите се наричат синтази. Не трябва да се бъркат със синтетазите от VI група.

Фиг. 4-3-IV. Примери за лиази.

V. Изомеразни реакции
Ензимите са изомерази. Изомеразните реакции могат да протичат като цис-транс-превръщане, вътрешномолекулна оксидоредукция, вътрешномолекулно пренасяне на групи и пр. Даден е пример за хексозофосфат изомераза, която превръща глюкозо-6-фосфат във фруктозо-6-фосфат (фиг. 4-3-V).

хексозофосфат изомераза
глюкозо-6-фосфат ------> фруктозо-6-фосфат

Фиг. 4-3-V. Пример за изомераза.

VI. Лигазни (синтетазни) реакции
Ензимите са лигази (синтетази). При тези реакции от две молекули се синтезира нова молекула. Всяка синтеза е ендергонична и термодинамично невъзможна. Тя става възможна само ако се спрегне с едновременно протичаща силно екзергонична реакция (напр. хидролиза на АТФ). Лигазите (синтетазите) спрягат двата процеса. Даден е пример за ацил-КоА синтетаза, която образува ацил-КоА от мастна киселина и КоА с участието на АТФ (фиг. 4-3-VI).

Фиг. 4-3-VI. Пример за лигаза (синтетаза)

Забележки:
Вода участвува и при хидролизните процеси, и при лиазните, но по различен начин.
Разликата между синтази и синтетази е, че само синтетазите изискват енергия, най-често под форма на АТФ.

4.1.8 Представа за механизъм на ензимната катализа

Въпреки че в края на реакцията eнзимите като катализатори се възстановяват непроменени, те фактически участват активно в хода на реакцията - образуват със субстрата (S) междинен ензимно-субстратен комплекс (ЕS).

ES комплекси са много нестабилни, имат къс живот, трудно се изолират и изучават. Не при всички ензимни белтъци се знае детайлната пространствена организация, което също затруднява изучаването на ES комплекси. Но има доказателства, че те наистина възникват:
- промяна в спектъра на ензима при взаимодействие със субстрата - напр. при пероксидаза с простетична група хем;
- чрез рентгеноструктурен анализ са получени преки доказателства за образуване на ES комплекси;
- изолиранe на комплекси между ензим и инхибитор, който е структурен аналог на субстрата. Тези комплекси са по-стабилни и по-лесно се изолират.

В най-общ вид ензимно-катализираната реакция протича по следния начин:

Е + S -------> ES -------> EP --------> E + P

В рамките на този комплекс субстратът се преобразува в продукт на реакцията (P), временно свързан с ензима като ензим-продуктен комплекс (EP). Продуктът се освобождава от ензима, който може отново да свърже нова молекула субстрат. Всеки от трите съставни процеса притежава своя активираща енергия, по-ниска от енергията на некатализирания процес.

Активиращата енергия може да се понижи по четири различни механизма:
1) киселинно-основна катализа (напр. при рибонуклеаза);
2) индуциране на напрежение в субстратната молекула (напр. при лизозим);
3) ковалентна катализа (напр. при серинови протеази);
4) ентропийни ефекти.
Тези механизми не са предмет на този въвеждащ курс. Често ензимните реакции са от смесен тип. Напр. при лизозим се наблюдава комбинация от първите два механизма.

При реакциите, в които участва повече от един субстрат, или пък като втори субстрат действа някакъв коензим, реакцията протича по два главни механизма:
1) т.н. "пинг-понг"-механизъм (напр. при трансаминиране (глава 8);
2) последователен механизъм, като редът на свързването на субстратите може да бъде случаен или определен. Последователен механизъм се наблюдава при дехидрогеназите, в които ролята на втори субстрат се изпълнява от редокссистема.

4.1.9 Активен център

Ензимът взаимодейства със субстрата чрез своя активен център. Активният център е неголям участък по повърхността на ензимната молекула, където субстратът се свързва и се превръща в продукт.
В еднокомпонентни ензими активният център се състои от няколко аминокиселинни остатъка, които са отдалечени по протежение на полипептидната верига, но са близко разположени в пространството поради формиране на третична структура на белтъка. Напр. в активния център на химотрипсин участват Хис57, Асп102 и Сер195 (фиг. 4-4).

Фиг. 4-4. Представа за активен център в ензимната молекула.
Изображение на химотрипсин. Аминокиселинните остатъци в активния център са представени с пълен пространствен модел (full space), както следва: Хис57 в зелено, Асп102 в жълто и Сер195 във виолетово. Полипептидните вериги са в червено и синьо, модел тип "панделка". Образът е получен с програмата RasWin [4], ползвайки атомните координати на химотрипсин от файл 2cha.pdb [5] от PDB [6].

От химична гледна точка групите в активния център могат да бъдат най-различни -SH, -NH2, -ОН, имидазолово ядро и пр. От функционална гледна точка според Кошланд се различават 2 вида групи (фиг. 4-5), участващи в активния център:
- каталитични (вземат пряко участие в реакциите на превръщане на субстрата в продукт).
- контактни (прикрепват субстрата към активния център така, че атакуемата от ензима връзка да попадне в обсега на действие на каталитичните групи). В случаите, когато катализираната реакция изисква включването на две или повече различни субстратни молекули, контактните групи ги довеждат до най-благоприятна за реагиране позиция. Така контактните групи съдействат най-много за високата скорост на ензимно катализираните реакции.
Блокирането на каталитични или контактни групи води до загуба на езимната активност.

Фиг. 4-5. Схематично представяне на функционалните групи в активния център в ензима (по Т. Николов [2] с разрешение):
каталитични групи - червен цвят; контактни - син; конформационни групи извън активния център - зелен цвят. Несъществените за ензимната активност групи са неоцветени.

Освен това важни са и т.н. конформационни или помощни групи, които са извън активния център, но именно те фиксират определена пространствена конформация на ензимната молекула. Атакуването на връзки между тези групи при денатурация също води до загуба на биологичната активност. В огромната ензимна молекула има и групи, които не са от значение за ензимната активност. Модифицирането им не променя активността. Те обаче могат да са от значение за регулиране на ензимната активност под действие на различни фактори.

При двукомпонентните ензими в активния център групи предоставя и небелтъчната съставка. Тя предлага най-често каталитични групи, оставяйки за апоензима контактната функция. Например различни редокссистеми (НАД, ФАД или др.) предоставят групи, които отнемат водород от различни субстрати на дехидрогеназите.

При ензими с четвъртична структура има различни възможности за оформяне на активния център - той може да бъде общ за цялостния комплекс от субединици, или всяка субединица да има свой отделен активен център. Възможно е някои субединици да носят каталитични центрове, а други субединици да поемат регулаторни функции поради наличието на т.н. алостерични центрове, на които ще се спрем по-късно.

4.1.10.-4.1.10.1. Специфичност на ензимното действие. Реакционна специфичност

Представата за механизма на ензимно-субстратното взаимодействие чрез активния център на ензима обяснява добре защо ензимите са най-специфичните катализатори в сравнение с всички останали катализатори. Специфичността, реакционна и субстратна, е едно от най-съществените свойства на ензимите.

Реакционната специфичност се определя от възможностите на включените в активния център аминокиселинни остатъци да образуват или разграждат определен тип химични връзки. Пример за различна реакционна специфичност е даден на фиг. 4-6, където три различни ензими аминоацидооксидази (E1), трансаминази (Е2) и декарбоксилази (Е3) превръщат един и същи субстрат (аминокиселини) в три различни процеса до различни продукти (за подробности виж глава 8):

Фиг. 4-6. Различна реакционна специфичност на аминоацидооксидази, трансаминази и декарбоксилази на аминокиселини.

4.1.10.2 Субстратна специфичност

Субстратната специфичност се обяснява с високите стерични изисквания на активния център спрямо субстрата, произтичащи от определена ензимна конформация. Чрез пространствената организация на ензима се създава много добро химично и структурно съответствие на контактните и каталитичните групи в активния център към съответните групи от субстрата. Молекулните размери и разположението на йонни групи и хидрофобни участъци в ензима осигуряват възможност за свързване на определен, понякога единствен субстрат. Други ензими проявяват известна толерантност и могат да въздействат на няколко близки по структура субстрати. Например хексокиназата катализира фосфорилирането на глюкоза, фруктоза, маноза, глюкозамин и 2-дезоксиглюкоза, но с различна скорост.

Съществуват различни модели за обясняване на субстратната специфичност на ензимите.

Според модела на Фишер съществува априори абсолютно структурно и геометрично съответствие между активния център и субстратната молекула, така както е съответствието между секретна брава и ключ (фиг. 4-7-1). Водородни, йонни връзки и хидрофобни взаимодействия допринасят за свързването между ензима и субстрата. Този модел добре обяснява абсолютната субстратна специфичност при малък брой ензими - напр. уреаза (фиг. 4-8), аргиназа, сукцинат дехидрогеназа, амино-ацил-тРНК синтетази. Уреазата катализира единствено разграждането на уреа до амоняк и въглероден двуокис. Субстрати като тиокарбамид (има геометрично, но липсва химично съответствие) или биурет (има химично, но не и геометрично съответствие) не влизат в активния център. Изследвани са стотици съединения и резултатът е все един и същ - уреазата има един единствен субстрат. Абсолютната специфичност на амино-ацил-тРНК синтетазите осигурява недопускане на грешки при белтъчната биосинтеза.

Фиг. 4-7. Модели за взаимодействието между субстрата и активния център на ензима

1 - Абсолютно структурно и химическо съответствие от типа "ключ-ключалка" (Фишер);
2 - Индуцирано структурно притъкмяване (Кошланд);
3 - Индуцирано структурно притъкмяване плюс субстратно напрежение (Кошланд).

Фиг. 4-8. Уреаза - пример за абсолютно специфичен ензим. Уреазата разгражда само карбамид, но не и близките по структура тиокарбамид и биурет.

Моделът на Фишер не може да обясни всички случаи на взаимодействие между ензима и субстрата. Според Кошланд активният център и субстратът не съвпадат напълно стерично. Взаимодействието на ензима и субстрата предизвиква конформационни промени в свързващото място, което се променя - увеличава се афинитетът към субстрата, преориентират се някои групи и се оформя каталитичният активен център. Това е т. н. модел за индуцираното структурно притъкмяване между ензима и субстрата (фиг. 4-7-2). Пример за подобни промени дава ензимът хексокиназа, която придвижва един от домените си, за да обгърне глюкозата и да доближи групите от активния център до субстрата.

Най-голям брой експериментални наблюдения подкрепят модела, който е съчетание от индуцирано структурно притъкмяване и субстратно напрежение (фиг. 4-7-3). За да се осъществи реакцията, е необходимо да настъпят, макар и незначителни, конформационни изменения и в активния център, и в субстратната молекула. Необходимо е стерично донагласяне на реагиращите структури и в резултат се получава напрягане и отслабване на атакуваните връзки. Например при свързване на субстрата от ензима лизозим, са доказани конформационни промени в част от субстратната молекула (хексозен пръстен преминава от стабилна "стол" в нестабилна "полу-стол"-конформация).

Ензимите, чиито субстрати или продукти са оптично активни вещества, проявяват стереоспецифичност (виж табл. 4-3 за примери).

Табл. 4-3. Примери за стереоспецифични ензими.

Ензим
Действие
Гликозидази Разграждат само a- или само b-гликозидна връзка. Проявяват абсолютна специфичност към една от съставките в гликозида
Малтаза Действа на малтоза ( a-1,4-гликозидна връзка между 2 глюкозни остатъка);
не действа на b-гликозиди;
не действа на a-гликозиди на галактоза;
не действа на a-гликозиди на маноза;
Ензими от гликолиза и ПФП Действат само на D-формите на метаболитите
Аминоацидооксидази Действат само на D- или само на L-аминокиселини
Фумараза Действа само на транс-изомера фумарат,
не действа на цис-изомера малеинат
Рацемази Превръщат обратимо един изомер в неговия антипод: напр. цис в транс, D в L

Стереоспецифичността се обяснява от Огстон с множествено (най-малко в три точки) свързване на субстрата към активния център. Ако само една група трябваше да се свърже с активния център, то много съединения биха подхождали. Но комбинацията от три групи рязко намалява броя на възможните съединения. Това обяснява и защо химически напълно еднакви съединения, различаващи се само по положение на една група, се разпознават от ензима. Ензимите могат да различават и химически еднакви групи в симетрични субстратни молекули като например глицерол или цитрат. От глицерол се получава само L-глицерол-3-фосфат (фиг. 4-9). Симетричната цитратна молекула се подлага на асиметрична атака от аконитазата при получаване на изоцитрат (виж глава 5).

Фиг. 4-9. Стереоспецифичност при някои ензими, дължаща се на множествено свързване между субстрата и активния център. Пример: свързване на симетричен субстрат (глицерол) към асиметричния активен център на глицерол киназа.

Интересен е примерът с пептидазите от стомашно-чревния тракт. Те хидролизират не всички пептидни връзки в белтъци, а само при някои аминокиселинни остатъци - вж фиг. 4-10. Специфичността по отношение на остатъка при атакуваната пептидна връзка се дължи на различните групи, които има в свързващото място на всеки ензим. Трипсин (от панкреас) хидролизира пептидна връзка след базични положително заредени остатъци от лизин или аргинин, тъй като в мястото, свързващо субстрата, има отрицателно заредени групи. Пепсин (от стомашен сок) разгражда пептидни връзки преди и след ароматни остатъци. Химотрипсин (от панкреас) хидролизира пептидна връзка най-вече след ароматни остатъци. При пепсин и химотрипсин в свързващото място има хидрофобни групи, които взаимодействат с ароматните ядра на фенилаланин, тирозин и триптофан. С тази специфичност тези три пептидази, изолирани от животни и пречистени, са оказали неоценима услуга за установяване на първични структури на белтъци - виж глава 1.

Фиг. 4-10. Специфичност при пептидази.

Някои ензими, напр. карбоксилестеразите, са с по-слабо-изразена специфичност - изискват наличието само на определена химична връзка (естерна), без да имат строга избирателност към съставките, които изграждат тази връзка (различни киселини и алкохоли).

Биологичното значение на субстратната специфичност е огромно. Без това удивително свойство на ензимите, не е възможен какъвто и да е порядък в обмяната в клетката.

Благодарение на ензимната специфичност биохимията е постигнала големи успехи при изследване естеството на връзката ензим-субстрат, а оттам и за изучаване структурата на активния център на ензима. За тези изследвания се използват серия модифицирани субстрати, така че всяка от групите, участваща в реакцията, да бъде модифицирана в един от тези субстрати. Изследва се влиянието на модификацията върху процеса на свързването на субстрата и на способността на ензима да атакува субстрата.

Благодарение на субстратната специфичност може да се смесва чист субстрат с груб ензимен препарат, в който количеството на примесите надвишава 1000 пъти количеството на самия ензим, и в тези условия да се определя активността на ензима с достатъчна точност.

4.2.-4.2.1. Ензимна кинетика: резюме

Ензимната кинетика изучава промените в скоростта на ензимните реакции под влияние на различни фактори.

Експерименталната крива, описваща зависимостта на скоростта от концентрацията на субстрата, е правоъгълна хипербола. Тя отразява една от най-характерните особености на ензимните реакции, а именно насищането на ензима със субстрат. След определена концентрация, повишаването на концентрацията на субстрата не води до увеличение на скоростта и тя остава постоянна и максимална (Vmaх).

Ензимната кинетика е подробно анализирана от Михаелис и Ментен. В основата на анализа си изследователите поставят образуването на междинен ензим-субстратен комплекс. Анализирайки математически зависимостта на скоростта (V) на образуване и разграждане на ензим-субстратния комплекс от концентрацията на субстрата [S], изследователите извеждат теоретично уравнение, отразяващо експериментално установената правоъгълна хипербола. В тяхна чест това уравнение се нарича уравнение на Михаелис-Ментен.

Константата на Михаелис (Кm) числено е равна на тази концентрация на субстрата, при която скоростта е равна на половината от максималната. Кm е важна кинетична характеристика за всяка ензимна реакция, защото дава информация за сродството между ензима и субстрата. Колкото Кm е по-ниска, толкова сродството е по-високо. Експерименталното определяне на (Кm) и на Vmax от хиперболичната зависимост на V от [S] е неточно и създава затруднения. По тази причина за определянето им се използват различни трансформации на уравнението на Михаелис-Ментен, най-популярната от които е уравнението на двойните реципрочни стойности или уравнение на Lineweaver-Burk. Това e уравнение на права линия, с две променливи 1 / V и 1 / [S]. От пресечните точки на получената права и осите на координатната сис тема се определят двете кинетични характеристики - (Кm) и на Vmax.

Определянето на ензимната активност се осъществява с помощта на директни и индиректни методи. Активността на ензимите се изразява с помощта на единицата катал. Един катал е количеството активност, която превръща 1 мол субстрат за една сек.

Зависимостта на скоростта на ензимните реакции от рН е крива с максимум. Този ход се определя от промени в дисоциацията на функционални групи в активния център и извън него, както и на групи в субстратната молекула. Това рН, при което скоростта на ензимната реакция е максимална, се определя като рН оптимум. Зависимостта на V от температурата също е крива с максимум.. Понижаването на активността след достигане на температурния оптимум отразява биологичните свойства на катализатора и е свързано с промяна в структурата на активния център в резултат на топлинна денатурация на белтъчната молекула.

Познанията върху ензимната кинетика са необходими за разбиране на някои случаи на хетерогенното заболяване подагра, характеризиращо се с увеличено образуване на пикочна киселина. Последната има много ниска разтворимост и при увеличено образуване, се отлага в стави и др. тъкани, което е изключително болезнено. Аномално високата активност на ензима фосфорибозилпирофосфат синтетаза в едни пациенти се дължи на увеличена Vmax, а в други на снижена Кm (увеличено сродство към субстрата). Промени в рН оптимума на алкохол дехидрогеназата и повишена Кm на ацеталдехид дехидрогеназата при азиатци е причина за повишената им чувствителност към етанол.

4.2.2 Зависимост на скоростта на ензимната реакция от концентрацията на субстрата

Ензимната кинетика изучава зависимостта на ензимно-катализираните реакции от различни фактори.
Експерименталната крива, описваща зависимостта на скоростта на ензимната реакция от концентрацията на субстрата, е правоъгълна хипербола (фиг. 4-11). За разлика от химичните реакции, където скоростта нараства пропорционално на концентрацията на реагиращите вещества, тук скоростта нараства линейно само при ниски субстратни концентрации. При по-високи концентрации скоростта нараства забавено, а при много високи концентрации скоростта не зависи от субстратната концентрация и клони към определена максимална стойност. Тази зависимост, отличаваща ензимните от химичните реакции, се дължи на междинното образуване на ензим-субстратен комплекс.

Фиг. 4-11. Зависимост на скоростта на ензимната реакция от концентрацията на субстрата.

Michaelis и Menten са дали математически израз на описаната експериментално установена зависимост. Макар че и други учени са работили по този въпрос, изведеното уравнение и до днес се нарича уравнение на Михаелис-Ментен в тяхна чест.

Michaelis и Menten са разгледали случая на едносубстратна еднопосочна реакция, протичаща в два етапа със скоростни константи k+1, k-1 и k+2 :

Извеждането на уравнението на Michaelis-Menten се основава на допусканията, че:
1) k+2 << k-1 , k+2<< k+1
2) [S] >> [E],
Тогава общата скорост на процеса V ще се определя от най-бавния етап (разграждането на ЕS до ензим и продукт), т.е.

V = k+2 [ES] (4.2.2)

Концентрацията на ЕS остава постоянна (стационарна), тъй като
Vобразуване на ES = Vразграждане на ES (4.2.3)

или съгласно закона за действие на масите:
k+1([E] - [ES]) [S] = k-1 [ES] + k+2 [ES] (4.2.4)

където ([E] - [ES]) е концентрацията на свободния ензим (разлика мeжду началната концентрация и тази на ензима, ангажиран в ES).
Чрез прости аритметични преобразувания се получава стойността на [ES]:

В хода на преобразуванията отношението от скоростните константи се представя като една нова сборна константа, означавана като константа на Michаelis (Km):

Значението на Кm ще бъде разгледано в т.4.2.4.
Ако получената стойност за [ES] в (4.2.5) се замести в (4.2.2), получава се първата форма на уравнението на Michaelis-Menten (4.2.7):

 

При насищане, когато [S] >> [E], цялото количество ензим е включено в ЕS (няма свободен ензим), т.е. [ЕS] = [E].

Тогава скоростта е максимална и се представя, както следва:

Vmax = k+2 [E] (4.2.8)

Използвайки равенството (4.2.8), от (4.2.7) може да се получи и втора форма на уравнението на Michaelis-Menten (4.2.9):

4.2.3 Анализ на уравнението на Michaelis-Menten

В него има три променливи: V, [S] и [E] (фиг. 4-13). Ще разгледаме следните случаи:

Фиг. 4-13. Анализ на уравнението на Michaelis-Menten.

I. Нека субстратната концентрация [S] да е постоянна
Тъй като k+2 и Km също са константи,

то V = const. [Е] (4.2.10)

т.е. скоростта зависи правопропорционално от ензимната концентрация - графически зависимостта е права линия. Този частен случай на уравнението на Michaelis-Menten описва зависимостта на скоростта на реакцията от концентрацията на ензима.

II. Нека ензимната концентрация [E] да е постоянна
1) При много ниски субстратни концентрации ([S] << Km) , в знаменателя може да се пренебрегне [S] и

V = const . [S] (4.2.11)

т.е. скоростта при ниски субстратни концентрации зависи линейно от концентрацията на субстрата. Този частен случай описва началния линеен участък от хиперболата.

2) При високи субстратни концентрации ([S] >> Km), в знаменателя може да се пренебрегне Km и

V = Vmax [S] / [S] = Vmax = const (4.2.12)

т.е. скоростта при високи субстратни концентрации клони към максималната стойност и не зависи от концентрацията на субстрата. Този частен случай описва крайния участък от хиперболата в областта на платото.

4.2.4 Дефиниция и значение на константата на Michaelis и максималната скорост

Ако се положи V да бъде равна на 1/2 от Vmax и се замести в уравнениетона Michaelis-Menten (фиг. 4-14) , то константата на Michaelis е равна на тази субстратна концентрация, при която скоростта на реакцията е равна на половината от максималната скорост. Km има измерение на концентрация и нейните стойности са между 1 и 10-8 mol/L.

Фиг. 4-14. Извеждане дефиницията за Km като субстратна концентрация, при която V = Vmax / 2 .

Km е важна кинетична характеристика за всеки ензим, защото дава ценна информация за сродството между ензима и субстрата, макар и с известно приближение. Това е така, защото реалната експериментално определяна Km е близка по стойност до теоретичната дисоциационна константа Кs за разграждането на ензим-субстратния комплекс до ензим и субстрат в основното уравнение .

Фиг. 4-15. Сравнение на Кm и Кs

Кm се отличава от Кs само по това, че k+2 присъствува в числителя за Кm.
По условие k+2 << k+1 и k-1 . Затова Кm е близка по стойност до Кs.
Ниска Кs , т.е. нисък числител (малки концентрации на свободния ензим и субстрат) и висок знаменател (висока концентрация на ES) означава високо сродство между ензима и субстрата. Така че, колкото Кs е по-ниска, толкова сродството между ензима и субстрата е по-високо. Обратно, висока Кs означава ниско сродство. Кs е теоретична константа, която не може да се измери експериментално, защото процесът в действителност не спира до образуване на ES, а продължава до образуване на продукт. Кm е реалната величина, която лесно се определя експeриментално и която с близко приближение дава информация за сродството между ензима и субстрата. Колкото Кm е по-ниска, толкова сродството между ензима и субстрата е по-високо. Обратно, висока Кm означава ниско сродство.

Кинетичните характеристики Km и Vmax са специфични за всеки ензим. Те имат и практическо значение. При [S], надвишаваща 100 пъти Km, обикновено V = Vmax. Това условие би трябвало да се спазва при определяне на ензимната активност. Vmax отразява количеството на наличния ензим. Km показва колко субстрат трябва да се използва, за да се измери Vmax.
Информация за клинично приложение на кинетичните параметри има в т. 4.2.10.1.

4.2.5 Определяне на константата на Michaelis и максималната скорост чрез уравнението на Lineweaver-Burk

Експерименталното определяне на Кm от хиперболата е възможно. Но поради неточно определяне на Vmax в областта на платото и необходимостта от голям брой точки, обикновено уравнението на Michaelis-Menten се трансформира в уравнение на двойните реципрочни стойности или уравнение на Lineweaver-Burk (4.2.10), както е дадено на фиг. 4-16. Това е уравнение на права линия от вида (у = ах + b), неминаваща през началото на координатната система, с две променливи 1/V и 1/[S]. От пресечните точки на правата с осите се определят лесно и двете кинетични характеристики Km и Vmax.

Фиг. 4-16. Уравнение на Lineweaver-Burk (4.2.10).
Вляво - Извеждане;
Вдясно - Графическо представяне на уравнението.

4.2.6 Единици ензимна активност

Не всички ензими са максимално пречистени, не се знае молекулната им маса. Затова количеството на ензима не се изразява в тегловни единици. Еднакво тегло в мг от два различно пречистени препарата съдържат различно количество чист ензим.
Използват се следните относителни единици за ензимна активност: една международна единица (IU) представлява това количество ензим, което е необходимо за превръщане на 1 μmol субстрат за 1 минута (μmol/min). По-късно е въведена друга единица – katal (kat) или катал на български. Един katal е количеството активност, която превръща 1 mol субстрат за 1 секунда (mol/s). И за двете единици се използват техни подразделения - 1 μkatal, nanokatal, picokatal и пр.
Двете единици могат да се превръщат една в друга. По този начин за ензимното количество се съди по ензимната активност. Това е възможно, тъй като е показано, че при излишък на субстрат ензимната активност е право пропорционална на количеството на ензима.

4.2.7 Определяне на ензимна активност чрез директни и индиректни методи

1) Чрез директни спектрометрични или флуорометрични методи

При ензими, чиято небелтъчна съставка има характерни абсорбционни или флуоресцентни спектри във видимата или ултравиолетовата област, е възможно директно измерване на ензимната активност.
Напр. при дехидрогенази с коензими НАД или НАДФ се използва свойството, че в редуцирано състояние пиридиновите коензими имат максимум на поглъщане на светлината при 340 нм. Реакцията може да се следи при 340 нм или по увеличението на оптичната плътност за минута при редукцията или по нейното намаление при окислението на коензима. В дехидрогеназни реакции скоростта на образуване или изчезване на НАДН е директно пропорционална на ензимната концентрация, изразена в относителни единици. Така оптичната плътност при 340 нм се използва за количествен анализ на тези ензими.

Освен дехидрогенази, много други ензими могат да бъдат определяни чрез измерване скоростта на появата на цветен продукт или скоростта на изчезване на цветен субстрат.

В практиката се използват и флуоресцентни методи - когато небелтъчната съставка е флуоресциращо вещество. Напр. кофакторът пиридоксалфосфат има характерен спектър на флуоресценция и това прави неговото измерване лесно и удобно. Важно предимство на флуорометричните измервания е много по-високата им чувствителност спрямо спектрофотометричните, тъй като е нужно много по-малко количество вещество.

2) Индиректни методи

Те се прилагат при ензими, които не съдържат кофактори с характерни спектри на поглъщане или флуоресценция, но катализиращи реакции, спрегнати с дехидрогеназните - виж фиг. 4-17. Показано е определяне на хексокиназна активност, спрегната с глюкозо-6-Ф дехидрогеназна активност. Всички компоненти, освен хексокиназа, се добавят в излишък. Това са глюкозо-6-Ф дехидрогеназа, глюкоза, АТФ, Мg2+ и НАДФ+. Количеството на измерваната в пробата хексокиназа определя скоростта на цялостната реакция и следователно и скоростта на образуване на НАДФН, която се измерва при 340 нм.


Фиг. 4-17.
Фиг. 4-17. Индиректен метод за определяне на ензимна активност, в случая хексокиназа, чрез спрягане на реакцията с дехидрогеназна реакция.

4.2.8 Влияние на рН върху скоростта на ензимните реакции

Зависимостта на скоростта от рН е крива с максимум (фиг. 4-18). Този ход се определя от няколко ефекта на рН върху ензима и субстрата:
1) При екстремно ниски или високи рН настъпва денатурация на ензима;
2) Променят се зарядите на групи от субстратната молекула;
3) Променят се зарядите на групи от активния център на ензима или на важни конформационни групи извън него.

Фиг. 4-18. Ефект на рН върху скоростта на ензимната реакция.

Това рН, при което скоростта е максимална , се означава като рН оптимум. За повечето ензими рН оптимумът е около неутрални стойности на рН, но има и значителни отклонения - вж табл. 4-4. Наличието на различни йонизиращи групи в различните субстрати е причина за разлики в рН оптимума на един ензим.

Табл. 4-4. рН оптимуми на някои ензими*

Ензим
Субстрат
рН
пепсин
яйчен албумин
1,5
пепсин
казеин
1,8
a-глюкозидаза
a-метилглюкозид
5,4
a-глюкозидаза
малтоза
7,0
уреаза
карбамид
6,4-6,9
амилаза (панкреас)
скорбяла
6,7-7,2
амилаза (слад)
скорбяла
4,5
липаза (панкреас)
триглицериди
8,0
липаза (рициново семе)
триглицериди
4,7
кисела фосфатаза
b-глицерофосфат
4,5-5,0
алкална фосфатаза
b-глицерофосфат
9,0-10,0
аргиназа
аргинин
9,5-9,9
трипсин
белтъци
7,8

*С разрешение от Т. Николов [2]

4.2.9 Влияние на температурата върху скоростта на ензимните реакции

Зависимостта на скоростта на ензимната реакция от температурата е камбановидна крива с максимум (фиг. 4-19). Температурата, при която скоростта е максимална, се означава като температурен оптимум (Топт). Камбановидната крива е резултантна от две въздействия. Първоначално с увеличение на температурата скоростта нараства поради увеличаване кинетичната енергия на реагиращите молекули. След достигане на температурния оптимум, главно поради топлинна денатурация на ензима, скоростта започва да намалява. Температурният оптимум зависи от продължителността на топлинното въздействие. Ако ензимът действа по-продължително при по-висока температура, топлинната денатурация е по-изразена и температурният максимум се снижава.

Фиг. 4-19. Влияние на температурата върху скоростта на ензимната реакция.

За повечето ензими Топт е около или малко над температурата, при която съществуват клетките, съдържащи тези ензими. Интересни са т.н. термостабилни ензими в микроорганизми в горещи минерални извори, чийто Топт е близък до точката на кипене на водата.

При топлокръвните организми като човека, поддържащи постоянна телесна температура, промените в скоростта на ензимните реакции са без особено значение освен при хипотермия или треска. При животни, които не поддържат постоянна телесна температура, промените в скоростта на ензимните реакции е важна особеност, позволяваща оцеляването им.

4.2.10.-4.2.10.1. Приложение на познанията в медицината. Промени в константата на Michaelis и максималната скорост за ензима ФРФФ синтетазата при случаи на подагра

Подаграта е хетерогенна група от заболявания, възникващи по различни причини, но обединени от увеличеното образуване на пикочна киселина в организма във всички случаи. Поради ниска разтворимост, пикочната киселина се отлага най-често в стави, но и в други тъкани, което е изключително болезнено.
Английският лекар Thomas Sydenham, който сам е страдал от подагра, дава следното образно описание на подагрена криза: "Болният ляга да спи и заспива, чувствайки се нормално. Около 2 часа през нощта той се пробужда от силна болка в големия пръст на крака, по-рядко в петата или в глезена. Усещането прилича на болка при навяхване, другите части на крака като че ли са потопени в студена вода. След това започва треперене и треска. След известно време болката достига максимум и се разпространява в костите и ставите на стъпалото и коляното. Сега вече това е глождеща болка, тя потиска и измъчва. Усещането в поразения крак е толкова остро, че болният не може да понася дори тежестта на спалното бельо и сътресението от крачки в стаята. Болният прекарва нощта в мъчения, безсъница, непрестанно въртейки болния крак и променяйки позата. Той се мята през цялото време докато боли поразената става, все по-силно с развитието на пристъпа." (Цитатът е от Stryer, L. [2]).

Един от дефектните ензими, които са причина за усилено образуване на пикочна киселина, е фосфорибозилпирофосфат синтетаза (фиг. 4-20). Този регулаторен ензим от синтезата на пуринови нуклеотиди по т.н. път "синтеза de novo " е с аномално висока активност и това води до засилване на тяхната синтеза. При разграждането им като краен продукт в човека се образува повече пикочна киселина (урат).

Тази висока активност на ФРФФ синтетазата се дължи на мутации в гена за този ензим. Променената вследствие на мутации първична структура води до промени в конформацията и активността на ензима, отразени в промени на кинетичните параметри. В едни пациенти промените водят до снижена Km за субстрата рибозо-5-фосфат, а в други пациенти - до повишена Vmax[8].

Други нарушения в обмяната на пуринови нуклеотиди, водещи до подагра, са разгледани в т. 4.3.8.1. и т. 4.4.6. - фиг. 4-40.

Фиг. 4-20. Опростена схема на обмяната на пуринови нуклеотиди (de novo синтеза и разграждане), обясняваща ролята на ФРФФ синтетазата за натрупване на пикочна киселина и развитие на подагра.

4.2.10.2. Променен рН оптимум на алкохол дехидрогеназа и повишена константата на Michaelis на ацеталдехид дехидрогеназа при азиатци с повишена чувствителност към етанол

Азиатците са необикновено чувствителни към алкохол (по-лесно се опиват) и биохимичното обяснение се свежда до промени в ензимите, които метаболират алкохола.

Под действие на алкохол дехидрогеназа алкохолът се превръща в ацеталдехид, който всъщност предизвиква вазодилатация, зачервяване на лицето, ускорена сърдечна дейност (тахикардия). Ацеталдехидът се отстранява от ацеталдехид дехидрогеназа, която го окислява до ацетат (фиг. 4-21).



Фиг. 4-21. Разграждане на етанол под действие на алкохол дехидрогеназа и алдехид дехидрогеназа. При дефекти в ензимите, които го разграждат, се натрупва повече ацеталдехид, предизвикващ неприятните ефекти при пиене.

Алкохол дехидрогеназата има три полипептидни вериги ( a, b, g), кодирани от различни гени. В участъка, кодиращ b-веригата, са открити три алели, и съответно известни са три типа b-вериги: b1, b2 и b3 с рН оптимуми 10, 8.5 и 7.0 [9]. Причината са точкови мутации в два важни остатъка: Арг47 и Арг369, които в b1-веригата задържат с йонни връзки получаващия се НАДН и забавят отделянето му. В b2-веригата Арг47 е заменен с Хис, а в b3-веригата Арг369 е заменен с Цис (табл. 4-5). Хис и Цис имат по-ниски рК стойности и това измества рН оптимума към по-физиологични стойности. Улеснява се отделянето на НАДН, т.е. увеличава се активността на алкохол дехидрогеназата и след поемане на алкохол той бързо и лесно се окислява до вредния ацеталдехид.

Табл. 4-5. Точкови мутации в b-веригите на алкохол дехидрогеназата*

Остатък
рКa на остатъка
Верига
Остатъци
рН оптимум
Хис
6.0
b1
Арг47 + Арг369
10
Цис
8.3
b2
Хис47 + Арг369
8.5
Арг
12.5
b3
Арг47+Цис369
7.0

* По данни на [9].

Освен увеличена активност на алкохол дехидрогеназата, в азиатци е налице и забавено окисление на ацеталдехида [10]. Липсата на митохондрийна ацеталдехид дехидрогеназа с ниска Кm е една от причините за по-високо ниво на ацеталдехид след поемане на алкохол (табл. 4-6).

Табл. 4-6. Форми на ацеталдехид дехидрогеназа*.

Ензим
Европейци
Азиатци
Митохондрийна бързо движеща се при електрофореза форма на ацеталдехид дехидрогеназа с ниска Кm (висок афинитет за ацеталдехид)
има
липсва
Цитоплазмена бавно движеща се при електрофореза форма на ацеталдехид дехидрогеназа с висока Кm (нисък афинитет за ацеталдехид)
има
има

*По данни от [10].

При тях има само цитоплазмена ацеталдехид дехидрогеназа с висока Кm. Наред с увеличената активност на алкохол дехидрогеназата това обяснява по-лесното опиване при азиатци.

4.3.-4.3.1. Регулация на ензимната активност: резюме

За запазване на хомеостазата организмите регулират ензимната активност чрез:
1) промени в генната експресия (разгледано в гл. 15); и
2) чрез повлияване активността на наличните ензими посредством:
a) ефектори (инхибитори и активатори);
б) обратимо ковалентно модифициране, най-често фосфорилиране-дефосфорилиране.

Голяма част от съвременните фармацевтични средства действат като инхибитори на ензимното действие. Инхибиторите биват необратими и обратими. Необратимите инхибитори, сред които има силно действащи отрови, трайно снижават или прекратяват ензимната активност. Обратимите инхибитори биват конкурентни и неконкурентни.

Конкурентните инхибитори са структурни аналози на субстрати или на коензими. Тези инхибитори се свързват с групи от активния център на ензима. Инхибиторът взаимодейства само със свободен ензим. Ефектът на инхибиране зависи от съотношението в концентрациите на субстрата и инхибитора. Голяма група антивирусни, антибактериални и антитуморни лекарствени средства, наречени антиметаболити, спадат към конкурентните инхибитори. Разгледани са следните антиметаболити: аналози на пуринови и пиримидинови бази, антибиотикът пуромицин; ацикловир и ациклогуанозин; сулфонамиди; метотрексат; алопуринол.

Неконкурентните инхибитори се свързват с групи извън активния център на ензима. Ефектът на инхибиране зависи само от концентрацията на инхибитора. Инхибиторът взаимодейства както със свободен ензим, така и с ензим-субстратен комплекс.

Ролята на ензимни активатори се изпълнява от други ензими, или от междинни метаболити, или от метални йони.

Протеазите, необходими за процесите на храносмилане, кръвосъсирване и разтваряне на кръвни съсиреци, се синтезират като неактивни предшественици. Превръщат се в активни ензими чрез необратимо протеолитично откъсване на един или повече пептиди от веригата на преензима. При това се отблокират важни групи, необходими за формиране на активния център.

Алостеричното инхибиране спада към неконкурентното инхибиране. Тъй като има и алостерично активиране, по-общо се говори за алостерично повлияване. Алостеричните ефектори се свързват в специфични алостерични центрове, извън активния център. Това предизвиква конформационна промяна, която повлиява и ензимната активност. Обикновено алостерични ефектори са крайните продукти в синтезните вериги. Те повлияват или първия специфичен за веригата ензим или скорост-определящия ензим, или и двата, ако те не съвпадат.
Интересен е примерът с пациент, страдащ от подагра поради мутация, засягаща алостеричния център на един от регулаторните ензими от синтезната верига на пуринови нуклеотиди. Липсата на такъв център не позволява на ензима да "усети" натрупването на крайните продукти. Синтезата на пуриновите нуклеотиди се извършва непрекъснато, без спиране. А това създава условия за превръщането им в пикочна киселина. Като пример е описана и възможността за лечене на оротатемия чрез крайните продукти в синтезната верига на пиримидинови нуклеотиди, които инхибират началните регулаторни ензими.

Обратимото ковалентно фосфорилиране-дефосфорилиране е широко използван и много важен механизъм за регулиране на ензимната активност. В много регулаторни ензими има специфични серинови и треонинови остатъци, които под действие на протеин кинази се фосфорилират, а под действие на фосфатази се дефосфорилират. Някои ензими са активни във фосфорилираната си форма (напр. гликоген фосфорилаза), а други в дефосфорилираната (напр. гликоген синтаза). Така се повлиява активирането на наличен ензим. Много рецептори за хормони и растежни фактори имат тирозин киназна или автотирозин киназна активност. Фосфорилират се тирозинови остатъци в самия рецептор и в други цитоплазмени ензимни и неензимни белтъци. Това фосфорилиране на свой ред активира различни каскади, като освен метаболизма, се повлиява и генната експресия, т.е. синтезата на нов ензим.

4.3.2 Въведение

Независимо от промените във външното обкръжение, организмите запазват постоянство във вътреклетъчната среда благодарение на възможността за регулиране на ензимното действие. Това става чрез:
1) промени в абсолютното количество ензим като се индуцира или репресира неговата синтеза (виж гл. 15). Скоростта на разграждане на ензимната молекула също може да бъде контролирана.
2) промени в активността на налични ензими - посредством ефектори (инхибитори и активатори) и чрез обратимо ковалентно модифицане, най-често фосфорилиране-дефосфорилиране.

Ензимната активност може да бъде повлиявана in vivo от присъствието на инхибитори или активатори. Изследванията с ензимни инхибитори in vitro са допринесли за изясняване механизма на действието на различни ензими, за идентифициране на групи в активни центрове, за изучаване на метаболитни пътища, за изясняване токсичното или лечебно действие на различни вещества, за осветляване на различни аспекти от въпроси върху растеж, развитие, стареене, рак, инфаркт, действие на хормони.

Голяма част от съвременните фармацевтични средства представляват ензимни инхибитори, действащи по различни механизми. Бактериални и вирусни инфекции се лекуват почти изключително с лекарства, които инхибират активността на ензими от бактериите и вирусите.

Инхибиторите биват необратими и обратими.

4.3.3 Необратимо инхибиране на ензимната активност

Като необратими инхибитори действат вещества, които блокират трайно и необратимо определена група в активния център на различни ензими, предоставена от апоензима или коензима - виж табл. 4-7. Повечето от тях са силно действащи отрови и изясняването на механизма на действие има значение за токсикологията.

Табл. 4-7. Примери за необратими инхибитори.

Необратими инхибитори Повлияван ензим Група от активния център, свързваща инхибитора
йодацедамид
p-хлормеркурибензоат
арсенови производни
тиолови ензими -SH група от ензима
агенти, блокиращи алдехидни групи: цианиди, натриев бисулфид и др. ензими, действащи с коензим пиридоксалфосфат - СНО група от коензима
диизопропилфлуорфосфат
(бойна отрова)
серинови протеази,
естерази, напр.
ацетилхолинестераза
- ОН група от ензима
яйчен белтък авидин карбоксилази групи от коензима биотин

4.3.4 Обратими конкурентни и неконкурентни инхибитори

Обратимите инхибитори биват конкурентни, неконкурентни и аконкурентни. Последните не са предмет на този курс.
В табл. 4-8 са сравнени характеристиките на конкурентните и неконкурентните инхибитори.

Табл. 4-8. Сравнение на обратимо конкурентно и неконкурентно инхибиране.

Конкурентно инхибиране
Неконкурентно инхибиране
1
Инхибиторът е структурен аналог на субстрата. Инхибиторът не е структурен аналог на субстрата.
2
Инхибиторът се свързва с активния център на ензима. Инхибиторът се свързва извън активния център на ензима.
3
Инхибиторът (I) реагира само със свободен ензим, не с ЕS. Получават се ЕI и ES комплекси (виж фиг. 4-22-1, дадена след табл. 4-8) Инхибиторът реагира и със свободен ензим, и с ЕS. Получават се ЕI, ES и ESI комплекси (виж фиг. 4-22-2, дадена след табл. 4-8)
4
Ензимът има афинитет и към субстрата, и към инхибитора, затова инхибиторният ефект зависи от съотношението в концентрациите на субстрата и инхибитора. Инхибиторният ефект зависи само от концентрацията на инхибитора.
5
Vmax се запазва, Km се повишава (понижено сродство) (виж фиг. 4-22-1, дадена след табл. 4-8)
Правите за неинхибиран и инхибиран ензим се пресичат в обща точка на ординатата (еднаква Vmax).
Vmax се понижава, Km се запазва (непроменено сродство) (виж фиг. 4-22-2, дадена след табл. 4-8).
Правите за неинхибиран и инхибиран ензим се пресичат в обща точка на абсцисата (еднаква Кm).
6
Примери: малонат (структурен аналог на сукцинат) инхибира сукцинат дехидрогеназата (виж фиг. 4-23)

Други примери - виж. следващата т. 4.3.5.

Примери: етилендиаминтетраацетат (ЕДТА) свързва метални йони, необходими за дейността на някои ензими; CN йон потиска активността на цитохром оксидазата. Виж също алостерично инхибиране - т. 4.3.7.

Фиг. 4-22-1. Конкурентно инхибиране.
Инхибиторът реагира само със свободен ензим. Получават се ЕS и EI комплекси.

Фиг. 4-22-2. Неконкурентно инхибиране.
Инхибиторът реагира и със свободен ензим, и с ЕS. Получават се ЕI, ES и ESI комплекси.

Фиг. 4-23. Пример за конкурентно инхибиране.
Малонат, като конкурентен инхибитор на сукцинат, инхибира сукцинатдехидрогеназата. Чрез двете карбоксилни групи малонат се свързва с активния център на ензима, но тъй като няма две съседни метиленови групи, не може да бъде дехидрогениран.

4.3.5 Антиметаболитите - конкурентни инхибитори по отношение на субстрати или кофактори на ензимите

Съвременната лекарствена терапия се основава на познанията за инхибиране на ензимното действие.
Лекарствата (антивирусни, антибактериални, антитуморни) се синтезират целенасочено с оглед инхибирането на определен ензим в определен метаболитен път, като стремежът е те да са с ограничена токсичност за пациента. Токсичността трудно може да се избегне, тъй като, с изключение на биосинтезата на клетъчната стена в бактерии, малко са метаболитните пътища, уникални за тумори, вируси или бактерии. Затова лекарствата, които убиват тези организми, са вредни и за клетките на човека и това трябва да се отчита при дозирането и времеприлагането.

Но при всички тези случаи се разчита на по-високата чувствителност на микроорганизмите или на туморните клетки към антиметаболитите в сравнение с тази на макроорганизма . По-високата чувствителност може да се дължи на това, че:
1) антагонистите засягат такива звена от обмяната, които са възлови за микроорганизма, а са второстепенни или липсват при макроорганизма;
2) макроорганизмът разполага с разнообразни защитни средства, които потискат дейността на антагониста или намаляват неговата концентрация.
Някои от тези антиметаболити са аналози на субстрати, други са аналози на коензими.

В глава 3 са разгледани аналози на пуринови и пиримидинови бази като 6-меркаптопурин, 5-флуорурацил, които наред с много други, прекратяват синтезата на нуклеиновите киселини в микроорганизми или тумори (т.3.11.1, фиг. 3-26).
По-долу (на фиг. 4-24, 4-25, 4-26, 4-27, 4-28) са дадени примери за някои антиметаболити, използвани за терапия на различни заболявания.

Антибиотикът пуромицин е структурен аналог на естерифицирания с аминокиселина 3'-край на Тир-тРНК и инхибира белтъчната биосинтеза в микроорганизми (фиг. 4-24).

Фиг. 4-24. Пуромицин - структурен аналог на Тир-тРНК, инхибитор на белтъчната биосинтеза.

На фиг. 4-25 са дадени формулите на ацикловир или ациклогуанозин (пуринов аналог) и 3'-азидо-3'-дезокситимидин (AZT) (пиримидинов аналог). Това са антиметаболити, които се използват за забавяне развитието на вируси, причиняващи херпес и СПИН. Механизмът на тяхното действие е разгледан в глава 9.

Фиг. 4-25. Примери за антиметаболити, използвани в терапията на СПИН - ацикловир или ациклогуанозин (пуринов аналог) и 3'-азидо-3'-дезокситимидин (AZT).

Сулфонамидите са голям клас съединения с обща формула R - SO2- NHR'. Сулфонамидът е най-простият представител (фиг. 4-26). Той е антибактериален агент, защото е структурен аналог на р-аминобензоена киселина. р-Аминобензоената киселина е част от по-сложно съединение фолиева киселина (ФК) (фиг. 4-27), която е необходима за синтеза на нуклеотиди и НК и поради това за бактериалния растеж. Бактериите не могат да поемат ФК от гостоприемника, те трябва да я синтезират. Включването на сулфонамида във ФК я прави неактивна и бактериите не могат да растат и да се делят.Човекът не синтезира ФК, за него тя е витамин, който поема с храната. Затова сулфонамидът не е вреден за него в дозите, които убиват бактериите.


Фиг. 4-26. Структура на някои антиметаболити: сулфаниламид - антиметаболит на р-аминобензоена киселина; алопуринол - антиметаболит на хипоксантин; 5-флуорурацил - антиметаболит на пиримидинови бази; 6-меркаптопурин - антиметаболит на пуринови бази.


Фиг. 4-26. Структура на някои антиметаболити: сулфаниламид - антиметаболит на р-аминобензоена киселина; алопуринол - антиметаболит на хипоксантин; 5-флуорурацил - антиметаболит на пиримидинови бази; 6-меркаптопурин - антиметаболит на пуринови бази.


Фиг. 4-27. Структура на метотрексат, антиметаболит на фолиева киселина.

Метотрексат (аметоптерин) се използува за лечение на детска левкемия (злокачествено делене на левкоцити), тъй като е близък структурен аналог на фолиева киселина. Инхибира редукцията на фолат до ФК.Н2 и ФК.Н4:

дихидрофолат редуктаза дихидрофолат редуктаза
ФК -----------------------------> ФК.Н2 -----------------------------> ФК.Н4

Метотрексатът се свързва 1000 пъти по-здраво от ФК.Н2 и затова е мощен конкурентен инхибитор на ензима. Не се получава тетрахидрофолат (ФК.Н4), който е необходим за синтезата на ТМФ. Спира синтезата на ДНК, клетъчното делене и развитието на левкемията. Но бързо делящи се човешки клетки от костен мозък също са чувствителни към лекарството. Освен това продължителна употреба предизвиква амплификация на гена за ФК.Н2-редуктазата, увеличава се синтезата на ензима и растежът на резистентните клетки.

Особено интересен е примерът с алопуринол, използван при лечение на хиперурикемия и подагра. На фиг. 4-28 е сравнена структурата на алопуринол и хипоксантин. Разликата при тях е само в размяната на атомите 7 и 8. В началото алопуринол действа като субстрат на ксантин оксидазата, а после като неин инхибитор. Ензимът го превръща в алоксантин, който остава здраво свързан с активния център. Затова подобни инхибитори се наричат самоубийствени субстрати.

Фиг. 4-28. Структура и механизъм на действие на алопуринол върху ксантин оксидазата.

Като много близък структурен аналог на хипоксантин, алопуринол действа като неин "самоубийствен субстрат".

Фиг. 4-29 обобщава действието на алопуринол. Освен като инхибитор на ксантин оксидазата, алопуринол снижава общата скорост на образуване на пурини по пътя de novo, защото свързва част от ФРФФ, който е междинен метаболит и активатор на този път.
След въвеждане на алопуринол се прекратява образуването на пикочна киселина. Концентрацията на хипоксантин и ксантин (по-разтворими) в серума се увеличава, а тази на пикочната киселина се снижава. Намаленото образуване на пуринови нуклеотиди снижава образуването на пикочна киселина.

Фиг. 4-29. Действие на алопуринол при лечение на хиперурикемия и подагра:
1) инхибира ксантин оксидазата като структурен аналог на хипоксантин;
2) снижава скоростта на синтеза на пуринови нуклеотиди, тъй като свързва ФРФФ, който е метаболит и активатор на този път.

4.3.6 Активиране на ензимното действие

Активатори са вещества, които повишават скоростта на катализираната реакция. Могат да бъдат ензими, метаболити, метални йони. При металните йони е трудно да се разграничи точно дали йонът действа като активатор или кофактор.

Тук влизат и случаите на алостерично активиране (виж т.4.3.7) и на превръщане на неактивни ензимни предшественици (преензими или проензими) в активни ензими, разгледано по-долу.

Преензимите са предшественици на протеази, необходими за три важни типа процеси: храносмилане, кръвосъсирване и за разтваряне на съсиреците.
Секретирането им като неактивни предшественици предпазва от смилателното им протеолитично действие, и така осигурява защита за тъканта, която ги произвежда. Освен това улеснява бързата им мобилизация, без да е необходима нова белтъчна биосинтеза. При превръщането им в активни ензими става необратимо протеолитично откъсване на един или повече пептиди от веригата на преензима, при което се намалява молекулното тегло, отблокират се важни групи, необходими за формиране на активния център. Настъпват конформационни промени и оформяне на активния център. Обикновено откъсването на блокиращия пептид или пептиди става под действие на друг ензим или автокаталитично.- така трипсиногенът съдържа в амино-края хексапептид, който се отделя под действие на ентерокиназа (пептидаза от чревния сок), а също и на самия трипсин автокаталитично (фиг. 4-30).


Фиг. 4-30. Активиране на ензимния предшественик трипсиноген в активен ензим трипсин. По Т. Николов, с разрешение.

От химотрипсиноген (245 аминокиселинни остатъци), под действие на трипсин и автокаталитично, се извършват следните промени:
1) разкъсва се пептидната връзка между 15 и 16 остатъци. Междинно се получават две вериги: 1-15 и 16-245.
2) От 1-15 се отделя дипептида 14-15, а от 16-245 се отделя дипептида 147-148.
Получават се три вериги 1-13, 16-146 и 149-245, които са свързани помежду си чрез дисулфидни връзки.

4.3.7 Алостерично повлияване

От биологична гледна точка най-важното неконкурентно инхибиране е алостеричното инхибиране. Всъщност по-общото понятие е повлияване. То включва инхибиране и активиране. Ефекторите биват отрицателни (инхибитори) и положителни (активатори). При него крайният продукт в метаболитната верига или друго съединение повлиява първия специфичен за веригата ензим, или скорост-определящия ензим, или и двата заедно, ако не съвпадат. Ефекторът няма структурна прилика със субстрата на повлиявания ензим. Алостеричният ефектор се залавя не за активния център, а за друг алостеричен център и предизвиква конформационна промяна, която повлиява и активния център - активността на ензима се инхибира или увеличава. При потискане на начален ензим от крайните продукти в дадена верига се използва и израза ретроинхибиране или потискане чрез обратна отрицателна връзка.

В ензимната молекула има един активен център, но няколко алостерични центрове, чрез които ензимът приема сигнали за разнообразни регулаторни въздействия. Алостеричните ензими са обикновено с четвъртична структура и за тях не е валидно уравнението на Michaelis-Menten. Вместо правоъгълна хипербола, зависимостта на V от [S] е сигмоидна крива. Алостеричното повлияване е застъпено при важни синтезни вериги - напр. синтеза на пуринови (фиг. 4-31 и пиримидинови нуклеотиди (фиг. 4-32).

На фиг. 4-31 се вижда, че получаващите се като крайни продукти пуринови нуклеотиди (АМФ и ГМФ) действат като алостерични инхибитори на първите два ензима в собствената си синтеза по пътя de novo. Тези ензими ФРФФ синтетаза и глутамин-ФРФФ амидотрансфераза са регулаторни и скорост-определящи. ИМФ, предшественик на АМФ и ГМФ, също действа като алостеричен инхибитор на тези ензими. ФРФФ е не само субстрат, но и алостеричен активатор на втория ензим.

Фиг. 4-31. Пример за алостерични повлиявания в синтезата на пуринови нуклеотиди (опростена схема).
С отрицателен знак е представено алостеричното инхибиране на двата регулаторни ензими от крайните продукти ИМФ, АМФ и ГМФ, а с положителен знак е представено алостеричното активиране на амидотрансферазата от ФРФФ.

Пиримидиновите, както и пуриновите нуклеотиди инхибират алостерично собствената си синтеза, но съществува и по-сложна регулация между двата вида нуклеотиди - напр. АТФ активира синтезата на пиримидинови нуклеотиди ( фиг. 4-32 в т. т. 4.3.8.2. Така се уеднаквява скоростта на образуване на двата вида нуклеотиди.

4.3.8.-4.3.8.1. Примери за приложение на познанията върху алостерично повлияване в клиничната практика. Дефект в алостеричното повлияване на ФРФФ амидотрансфераза от крайните продукти - причинява подагра

Познанията върху алостерично повлияване позволяват да бъде обяснен и друг механизъм за възникване на подагра, освен разгледаните случаи в т. 4.2.10.1 (мутации в ензима, водещи до повишена Vmax или намалена Km). Подагра може да възникне и поради мутация, засягаща алостеричен център за потискане на главния регулаторен ензим ФРФФ амидотрансфераза от крайните продукти (пуриновите нуклеотиди) [11] - виж фиг. 4-31 в т. 4.3.7. Дефектният алостеричен център не "усеща", че има достатъчно пуринови нуклеотиди и ензимът не се инхибира. Увеличеното количество на пуринови нуклеотиди е причина за получаване на повече пикочна киселина, както бе вече показано.

4.3.8.2 Лечение на оротатурия чрез алостерични инхибитори

Познанията върху алостерично повлияване позволяват провеждане на лечение при оротатурия. Това е наследствено заболяване, свързано с нарушения в синтезата на пиримидинови нуклеотиди (фиг. 4-32). Има недостатъчност на два ензима в биосинтезната верига на пиримидинови нуклеотиди: оротат фосфорибозил трансфераза (Е5) и оротидин-5'-фосфат декарбоксилаза (Е6), което води до натрупване на междинния метаболит оротат в кръвта, а оттам той минава и в урината. Липсват крайните продукти пиримидинови нуклеотиди, а те са необходими за синтеза на НК, за клетъчното делене, особено за еритропоезата. Пациентите са бледи и отпаднали.

Фиг. 4-32. Лечение при оротатемия чрез пиримидинови нуклеотиди, които като крайни продукти алостерично инхибират ендогенната синтеза.

На фиг. 4-32 е показано мястото на действие на пиримидиновите нуклеотиди като алостерични инхибитори върху началните регулаторни ензими в тяхната синтеза. УТФ и ЦТФ инхибират двата начални ензима, а ТДФ снема активиращия ефект на ФРФФ.

Приемането на липсващите нуклеотиди (а дори и нуклеозиди) подобрява състоянието. Изчезва оротат в урината. Това става, тъй като добавените нуклеотиди потискат чрез обратна връзка началните ключови ензими карбамилфосфат синтетаза и аспартат транскарбамилаза.

4.3.9.-4.3.9.1. Регулация на ензимите чрез обратимо ковалентно фосфорилиране-дефосфорилиране: общи принципи

Известни са различни случаи на регулиране на ензимната активност чрез обратима ковалентна модификация като метилиране, аденилиране, фосфорилиране и др. Сред тях обратимото ковалентно фосфорилиране-дефосфорилиране на ензими е най-широко застъпеният и съществен регулаторен механизъм. Селективното фосфорилиране се катализира от протеин кинази, а последващото дефосфорилиране - от протеин фосфатази.

Протеин киназите фосфорилират специфични остатъци в регулаторни ензими (хидроксилни групи от серин и треонин, фенолна група от тирозин и хистидинови остатъци) като пренасят върху тях g-фосфатна група от АТФ. Фосфатазите катализират хидролитното отделяне на фосфатната група от тези остатъци.

За някои от повлияваните ензими активна е фосфорилираната форма - напр. гликоген фосфорилаза. При други ензими активна е дефосфорилираната форма - напр. гликоген синтаза.

Протеин киназите и протеин фосфатазите се означават като конверторни ензими. Ензимите, повлиявани чрез фосфорилиране-дефосфорилиране се наричат интерконвертируеми ензими. Самите протеин кинази и протеин фосфатази могат да бъдат и интерконвертируеми - т. е. също да бъдат регулирани чрез фосфорилиране-дефосфорилиране. Конверторните ензими и интерконвертируемите ензими са част от регулаторни каскади, всяка от които реагира на сигнал, пренасян от хормон или вторичен посредник.

4.3.9.2 Сравнение с ретроинхибиране

Обратимото ковалентно фосфорилиране-дефосфорилиране на ензими прилича на алостеричното инхибиране (ретроинхибиране - виж т. 4.3.7. със следните особености:
1) осигурява бърза регулация на ензимното действие в отговор на специфични физиологични сигнали.
2) действа в ранен етап на метаболитната верига, като обикновено се повлиява първият специфичен за веригата регулаторен ензим.
3) Въздейства върху алостерични центрове, а не върху каталитичния център.

Различава се от ретроинхибирането по това, че при ретроинхибирането се повлиява единичен ензим и не участват хормонални и нервни въздействия. Регулацията чрез фосфорилиране-дефосфорилиране включва няколко ензима и е под директен нервен и хормонален контрол. Освен това се изисква АТФ като донатор на фосфатна група.
Ретроинхибирането действа, без да променя генната експресия, като повлиява активирането на наличен ензим. При фосфорилиране-дефосфорилирането в едни случаи генната експресия не се променя (напр. при описаната в т. 4.3.9.3. каскада, включваща протеин киназа А). Чрез фосфорилиране обаче могат да се задвижат и други пътища, водещи до промяна в генната експресия. Много рецептори за хормони (напр. инсулин) и растежни фактори имат тирозин киназна или автотирозин киназна активност. (виж т. 16.7.4). Фосфорилират се тирозинови остатъци в самия рецептор и в други цитоплазмени ензимни и неензимни белтъци. Това фосфорилиране на свой ред активира различни каскади, повлияващи генната експресия, т.е. синтезата на нов ензим.

4.3.9.3 Пример - каскада за повлияване на гликоген фосфорилаза и гликоген синтаза чрез фосфорилиране-дефосфорилиране

На фиг. 4-33 е представена опростена схема за активиране на гликоген фосфорилазата и инхибиране на гликоген синтазата чрез каскада от реакции на фосфорилиране, задвижена от хормона адреналин, отделящ се при стрес. Свързването на този хормон към специфичен мембранен рецептор (разгледано подробно в гл. 17) води до активиране на ензима аденилат циклаза. Аденилат циклазата превръща АТФ в цикличен АМФ, който активира протеин киназа А. Оттук започват няколко реакции на фосфорилиране.

Протеинкиназа А фосфорилира и активира киназата на фосфорилазата, а тя фосфорилира неактивната гликоген фосфорилаза b и я превръща в активна гликоген фосфорилаза a, необходима за разграждане на резервното гориво гликоген.


Фиг. 4-33. Пример за регулация на ензими чрез фосфорилиране-дефосфорилиране - активиране на гликоген фосфорилаза и инхибиране на гликоген синтаза чрез каскада от реакции на фосфорилиране, задвижена от хормона адреналин. Дефосфорилирането инхибира фосфорилазата и активира гликоген синтазата.

Протеин киназа А фосфорилира и гликоген синтаза a, но с това я инактивира - превръща я в неактивна гликоген синтаза b.

Така координирано и реципрочно се регулират регулаторните ензими на двата противоположни пътя - разграждане и синтеза на гликоген. Когато фосфорилазата е в активната си фосфорилирана форма, фосфорилираната гликоген синтаза е неактивна и обратно. Активната форма на фосфорилирания ензим се означава с буквата "а", а неактивната форма - с буквата "b". Дефосфорилирането чрез фосфопротеин фосфатаза 1 инхибира гликоген фосфорилазата и активира гликоген синтазата (фиг. 4-34). Активните форми на ензимите са дадени на зелен фон, а неактивните - на червен. Мембранно-разположеният рецептор на адреналин и предаването на хормоналния сигнал са описани в глава 17.


Фиг. 4-34. Фосфорилиране на гликоген фосфорилаза и гликоген синтаза под действие на протеин киназа А и дефосфорилиране под действие на фосфопротеин фосфатаза 1.

4.4.-4.4.1. Клинично значение на ензимите: резюме

Познанията върху ензими намират широко приложение в клиничната практика. Голям брой заболявания са пряко свързани с промени в ензимна активност и нейното определяне дава ценна информация за протичащите в организма процеси. Определянето на ензимни активности в кръв и други биологични течности се използва в диагностиката на различни заболявания. Важно е спазването на определени правила, както при вземане на кръвни и други проби, така и при определяне на ензимната активност.

Съвременните направления в ензимната диагностика се основават на:

1)Доказване на нехарактерни за серума вътреклетъчни ензими;
Специфични маркери за заболяване на даден орган са напр.увеличението на кисела фосфатаза при карцином на простатата; на трансаминази при вирусен хепатит и др. При инфаркт се следят промените в креатинфосфокиназа, глутамат-оксалацетат трансаминаза и лактат дехидрогеназа. Особено ценни са изоензимите, специфични за даден орган - напр. МВ-изоензимът на креатинфосфокиназата произхожда само от миокарда, затова при сърдечен инфаркт винаги се следи този изоензим. Електрофореграми и денситограми на изоензими на лактат дехидрогеназата се използват за диагностика на сърдечни и чернодробни увреждания.

2) Установяване на промени в типичните за серума функционални ензими;
Диагностично значение има намаляване на активността им, което е признак за нарушение във функцията на органа, който ги произвежда.

3)Доказване на генетично обусловени ензимопатии.
Това са наследствени заболявания, при които поради мутация в гена, се синтезира ензим с променена първична структура и пространствена организация, който не упражнява своята биологична функция. При блокиране на ензимното действие се натрупва субстратът на реакцията, който обикновено се насочва в страничен път и там се получават вредни съединения. Не се получава нормалният продукт и това допълнително оказва неблагоприятни ефекти.

4) Използване на специфични рестриктази за директно изследване секвенцията на ДНК и установяване дефекти в гените.

Ензимите намират приложение и за терапия на някои заболявания. Напр. стрептокиназа и алтеплаза се използват при инфаркт като тромболитични агенти, тъй като превръщат плазминоген в активен плазмин, който разтваря фибринови съсиреци. Аспарагиназа се използва при лечение на някои форми на левкемия, тъй като разграждайки аспарагин в плазмата, снижава нивото му под необходимото за туморните клетки.

Имобилизираните ензими (ензими, свързани към неразтворима мембрана) са по-стабилни спрямо денатуриращи фактори и поради това работят с висок капацитет продължително време. Прилагат се за бързи скриниращи изследвания на населението - напр. за определяне на холестерол с имобилизирана холестерол оксидаза. Използват се и във фармацевтичната промишленост за производство на някои лекарства.

Ролята на комплекси "ензим-антитяло" в клиничния анализ е разгледана чрез примера за определяне белтъците на вируса на СПИН по метода ELISA.

4.4.2 Изисквания при определяне активността на ензими в клиничната практика

При вземане на кръвни проби за ензимни определения трябва да се избегне възможността за денатурация на интересуващите ни ензими. Недопустимо е интензивно разклащане и нагряване на кръвните проби. Трябва да се внимава и с използваните антикоагуланти или консерванти, тъй като някои от тях могат да действат инхибиращо върху някои ензими. Определенията за ензимна активност не трябва да се правят с хемолизирала кръв. Това е особено важно, тъй като освободените от еритроцитите ензими биха завишили резултатите.

Ензимната активност зависи от температурата и рН, така че за да се сравняват резултатите с нормалните стойности, необходимо е ензимните определения да се извършват при стандартни условия и излишък от субстрат. Въпреки старанията, обикновено има известни вариации в ензимната активност при различни лаборатории.

4.4.3 Роля на нехарактерни за серума вътреклетъчни ензими за диагностиката на различни заболявания

Появата на неспецифични за плазмата вътреклетъчни ензими е ценно от диагностична гледна точка. Обикновено плазмените нива на тези ензими са ниски или нулеви. Увреждането на тъкани променя клетъчната мембранна пропускливост или предизвиква смърт на клетки, което води до освобождаване на вътреклетъчни ензими в плазмата. Когато има промени в пропускливостта, по-нискомолекулните ензими ще се появят първи в плазмата. Колкото е по-голям концентрационният градиент между клетъчните и извънклетъчните нива, толкова по-бързо ще дифундира ензимът навън. Цитозолните ензими се появяват преди митохондрийните. Колкото по-голяма част от тъканта е увредена, толкова е по-голямо увеличението в плазменото ниво. Неспецифичните за плазмата вътреклетъчни ензими се отстраняват от плазмата с различни скорости, което зависи от стабилността на ензима и поемането му от ретикулоендотелната система.

Има ензими, които са специфични маркери за заболяване на даден орган,. Напр. киселата фосфатаза от простатната жлеза се увеличава при карцином на простатата. При остър панкреатит се увеличават липаза и амилаза. При вирусен хепатит е увеличена глутаматпируват трансаминаза (синоним аланинаминотрансфераза).

На фиг. 4-35 са дадени ензимите, които най-често се използват за диагностика на инфаркт. Първи в серума (още след 4-я час) се увеличава ензимът креатинфосфокиназа. Обикновено между 12-ия и 14-ия час активността му е максимална. Стойностите му се нормализират между 48-ия и 60-ия час.

Малко по-късно, след 6-ия час, се повишава и глутамат-оксалацетат трансаминаза (синоним аспартат аминотрансфераза) и достига максимум между 12-ия и 14-ия час. Стойностите се нормализират след 4-ия ден.

Най-късно (след 24-ия до 48-ия час) се наблюдават увеличени нива на лактатдехидрогеназата. Активността е максимална между 4-ия и 6-ия ден. Стойностите обикновено се нормализират след 8-ия ден.

Фиг. 4-35. Ензимни профили след инфаркт на миокарда.
1 - креатинфосфокиназа;
2 - глутамат-оксалацетат трансаминаза (синоним аспартат аминотрансфераза);
3 - лактатдехидрогеназа.

4.4.4.-4.4.4.1. Изоензими- определение

Изоензимите (изозими) са различни форми на един и същи ензим. Те имат еднаква субстратна и кофакторна специфичност, но различни Кm за субстрата или кофактора, или и за двата заедно.
Напр. малат дехидрогеназа от черен дроб на плъх и от Е. coli катализират една и съща реакция, но имат различни физични и химични свойства. Най-често изоензимите се разграничават чрез електрофореза.

В рамките на един организъм има изоензими от различни органи - напр. лактат дехидрогеназа (ЛДХ), или от различни клетъчни органели - напр. малат дехидрогеназа (МДХ), глутамат-оксалацетат трансаминаза (ГОТ).

Изоензимите са мултимерни комплекси. Те имат четвъртична структура и са образувани от свързването на различен брой независимо кодирани субединици. Поради разлики в първичната структура, субединиците имат различни изоелектрични точки и оттук комбинациите от тях имат различна електрофоретична подвижност. Субединиците се номерират, като № 1 получава най-бързо движещият се към анода изоензим.

Разделянето и идентифицирането на изоензимите има диагностично значение.

4.4.4.2 Изоензими на креатинфосфокиназата (КФК)

Този ензим катализира обратимото фосфорилиране на креатин с АТФ (фиг. 4-36):
Фиг. 4-36. Действие и изоензими на креатинфосфокиназа.

Ензимът съдържа два вида субединици, означавани с буквите М и В (М - характерна за мускулите, от английската дума muscle и В - характерна за мозъка, от английската дума brain). При комбинацията на тези субединици могат да се получат и действително съществуват три димерни изоензима на креатинфосфокиназата. Единственият източник на МВ-изоензима в кръвта е миокардът и затова при потвърждаване на инфаркт на миокарда се следи този изоензим.

4.4.4.3 Изоензими на лактатдехидрогеназата (ЛДХ)

Този ензим катализира обратимата редукция на пируват до лактат. (фиг. 37). Тъй като ЛДХ е тетрамер от два вида субединици Н (от heart) и М (от muscle), възможни са 5 комбинации от тях или 5 вида изоензими, съдържащи различен брой от Н и М субединици.

Сумарната активност на ЛДХ в серума на здрав човек обикновено е 100-200 IU/L. ЛДХ се намира във всички тъкани. Увеличението на общата активност на ЛДХ в серума не е специфично за увреждането на някой орган. Увреждане на кой да е от тях може да доведе до освобождаване на ензима в кръвта.

Фиг. 4-37. Действие и изоензими на лактат дехидрогеназа.

Изследването на изоензимите на ЛДХ позволява да се определи от коя тъкан произхожда увеличения в плазмата изоензим. Съотношението на изоензимите на ЛДХ в човешкия серум се променя при различни заболявания - напр. инфаркт на миокарда (фиг. 4-38-I) или чернодробно увреждане (фиг. 4-38-II).


Фиг. 4-38-I. Електрофореграма и денситограма на изоензими на лактат дехидрогеназа. Електрофорезата е проведена върху целулозно-ацетатен гел, при рН 8.6. Най-бързо подвижен е изоензим 1.
Пациент с инфаркт на миокарда е сравнен със здрав човек. Увеличени са изоензими 1 и 2.

На фиг. 4-38-I се вижда, че при инфаркт на миокарда са характерни две особености: а) увеличават се изоензими 1 и 2; б) изоензим 1 има по-високи стойности спрямо изоензим 2.
Промяната в изоензими 1 и 2 едновременно с поява на КФК2 в 100 % от случаите е показател за инфаркт на миокарда.

На фиг. 4-38-II е даден електрофоретичният профил на изоензими на ЛДХ от пациент с хепатит и от здрав човек. За разлика от инфаркт, където са увеличени изозими 1 и 2, при хепатит е увеличен изоензим 5.


Фиг. 4-38-II. Електрофореграма и денситограма на изоензими на лактат дехидрогеназа. Електрофорезата е проведена върху целулозно-ацетатен гел, при рН 8.6. Най-бързо подвижен към анода е изоензим 1. Пациент с хепатит е сравнен със здрав човек. Силно увеличен е изоензим 5.

4.4.5 Промени във функционалните плазмени ензими - значение за диагностиката

Към функционалните плазмени ензими спадат преензимите за кръвосъсирване, преензимите за разтваряне на съсиреците, липопротеин липаза и др.
Физиологичната им функция се реализира в плазмата, където се секретират главно от черния дроб. Присъствуват в кръвта в равни или по-високи концентрации, отколкото в тъканите.
Диагностично значение има намаляване на активността им, което е признак за нарушение във функцията на органа, където се синтезират.
Напр. лецитин-холестерол ацилтрансфераза (превръща лецитина в лизолецитин, а свободния холестерол в холестеролов естер) - при заболявания на чернодробния паренхим нейната активност намалява, в кръвта нараства концентрацията на свободния неестерифициран холестерол ( в норма свободният е 1/3 от общия).
Плазмената холинестераза разгражда ацетилхолин. Синтезира се в черния дроб. Нейната намалена активност говори за увреждането му. Може да е признак за отравяне с фосфороорганични отрови - инсектициди, или хлороформ.
При сериозни увреждания на черния дроб като цироза не се произвеждат ензимите, необходими за обезвреждане на токсичния амоняк в урейния цикъл. Това може да доведе до амонячно отравяне и до чернодробна кома.

4.4.6 Доказване на генетично обусловени ензимопатии

Генетично-обусловените ензимопатии са наследствени заболявания, при които поради мутация в гена, се синтезира ензимен белтък с променена първична структура и променена пространствена организация, който не упражнява своята биологична функция. Спадат към т.н. молекулни болести или вродени метаболитни дефекти.
Характерно за тях е, че при блокиране на ензимното действие се натрупва субстратът на реакцията, а не се получава нормалният продукт (фиг. 4-39). Натрупващият се субстрат може да се насочи в страничен път и там да се получат вредни токсични съединения. Липсата на нормално получаващия се продукт в блокирания метаболитен път допълнително оказва неблагоприятни ефекти.

Фиг. 4-39. Метаболитен блок при генетично обусловени ензимопатии.

В хода на този курс вече са разгледани примери за генетично обусловени ензимопатии - виж първите пет случая в табл. 4-9. Вижда се, че заболяване може да настъпи както при намалена активност (примери 1 и 2 от табл. 4-9), така и при увеличена активност на определен ензим, напр. ФРФФ синтетаза (примери 4-6). По-чести са случаите на ензими с намалена или липсваща активност.

Табл. 4-9. Примери за генетично обусловени ензимопатии.

Заболяване
Променен ензим
Активност
1
фенилкетонурия (т. 2.5.3) фенилаланин хидроксилаза намалена
2
оротатурия (т. 4.3.8.2) оротатфосфорибозил трансфераза и оротидилат декарбоксилаза намалена
3
подагра (т. 4.2.10.1) ФРФФ синтетаза (увеличена Vmax) увеличена
4
подагра (т. 4.2.10.1) ФРФФ синтетаза (намалена Km) увеличена
5
подагра (вж 4.3.8.1) ФРФФ амидотрансфераза (загуба на алостерична чувствителност към пуринови нуклеотиди увеличена
6
подагра гуанозил фосфорибозил трансфераза намалена
7
синдром на Lesch-Nihan гуанозил фосфорибозил трансфераза липсва

Случаите 3, 4 и 5 в табл. 4-9 показват, че хетерогенното заболяване подагра може да възникне поради различни ензимни дефекти. Тук ще се дадат два допълнителни примера (№ 6 и 7 в табл. 4-9), също свързани с подагра.

Освен разгледания път de novo синтеза на пуринови нуклеотиди има и друг път, наречен синтеза от готови бази. Една от реакциите в този път (синтеза на ГМФ и ИМФ) е представена на фиг. 4-40. Тази реакция е пример за неизползване на субстрат, който повлиява друг обменен път. При намалена активност на ензима гуанозил/хипоксантин фосфорибозил трансфераза не се използва ФРФФ. Той се натрупва и стимулира пътя de novo. Синтезират се повече пурини и от тях повече пикочна киселина.

Фиг. 4-40. Механизъм на възникване на подагра при недостатъчност на гуанозин/хипоксантин-фосфорибозилтрансферазата
Ензимният блок води до неизползване и натрупване на ФРФФ, който усилва пътя de novo.

При пълна липса на гуанозин/хипоксантин фосфорибозил трансферазата се развива синдром на Lesch-Nihan (пример 7 от табл. 4-9). При това още по-тежко заболяване болните деца развиват всички признаци на подагра, но се наблюдават и психични отклонения - умствена изостаналост, агресивност по отношение на околните и стремеж да увреждат дори собствените си крайници.
Следващите глави съдържат много други примери за генетично обусловени ензимопатии.

4.4.7 Значение на рестриктази за директно изследване секвенцията на ДНК и установяване дефекти в гените

Рестриктазите са строго специфични ендонуклеази, които разкъсват полинуклеотидните вериги на ДНК в определени места. Те са изключително полезни за целенасочено срязване и картиране на генома, (както и за вмъкване на гени от един организъм в друг - генно инженерство).

Рестриктазите улесняват диагнозата на генетичните болести. Диагностицирането на тези болести чрез директни изследвания на секвенции от ДНК стана възможно благодарение на успехите на рекомбинантната ДНК технология (глава 16).

Чувствителността на тези методи е толкова голяма, че е възможна пренатална диагностика на наследствени заболявания. За целта се изследват клетки от амниотичната течност.

4.4.8 Ензими за терапия при инфаркт на миокарда и други заболявания

Съсирекът, предизвикал инфаркта, може да се разтвори под действие на активен плазмин. Активен плазмин се получава от неактивен плазминоген под действие на стрептокиназа и на алтеплаза (t-PA - съкратено от tissue plasminogen activator или тъканен активатор на плазминоген) - виж фиг. 4-41. Както стрептокиназата, така и алтеплазата се използват при лечение на инфаркт като тромболитични агенти. Техните качества са сравнени в табл. 4-10.

Фиг. 4-41. Значение на ензимите алтеплаза и стрептокиназа за терапия при инфаркт на миокарда.

Табл. 4-10. Сравнение на стрептокиназа и алтеплаза (t-PA) като
тромболитични агенти.*

Качество
стрептокиназа
алтеплаза (t-PA)
Селективност за фибринов съсирек
-
+
Предизвиква плазминемия
+
-
Намалява смъртността
+
+
Предизвиква алергична реакция
+
-
Предизвиква хипотензия
+
-
Приблизителна цена за лечението
$400
$2900

*Данните са от Webb. J., Thompson C. [12]. Валутата е в канадски долари.

Колкото по-рано започне терапията, толкова по-голяма надежда има за болния. Вкарването на стрептокиназа или алтеплаза трябва да стане бързо, преди да е настъпило необратимо увреждане на сърдечния мускул и обикновено не по-късно след 12-ия час. Обикновено дори 1 час след инфаркта някои клетки са необратимо увредени, а 6 часа по-късно миокардът като цяло се счита увреден, ако не е предприето нищо.

Получената чрез рекомбинантна ДНК-технология алтеплаза е не по-малко активна от стрептокиназата, не причинява алергични реакции, не предизвиква хипотензия, но е много по-скъпа. Затова в много кардиологични центрове се използва стрептокиназа, освен ако няма контраиндикации за алергия, предишна употреба, или хипотензия.

При някои форми на левкемия при възрастни се прилага терапия с ензима аспарагиназа. Този ензим разгражда аспарагин. Туморните клетки се нуждаят от аспарагин и го получават от плазмата на гостоприемника. Вкарването на аспарагиназа венозно намалява нивото на аспарагин в плазмата и това потиска жизнеспособността на тумора.

В бъдеще може би ще е възможно заместване на дефектни ензими.

4.4.9 Роля на имобилизирани ензими в клиничния анализ и за производство на лекарства

Имобилизирани ензими се наричат ензимите, свързани към неразтворима матрица (мембрана). Те са значително по-стабилни спрямо денатуриращи фактори (рН, температура, детергенти) и работят с повишен капацитет продължително време. Използват се успешно в рутинни и скриниращи изследвания.

Например определяне на холестерол при скрининг на населението може да стане за няколко минути с минимално количество плазма 10 mL (виж фиг. 4-42) с помощта на имобилизирана холестерол оксидаза, действаща спрегнато с пероксидаза. При окислението на холестерола под действие на този ензим, се отделя Н2О2, който окислява безцветно багрило до цветен продукт. Последният се измерва спектрофотометрично. По подобен начин се определят и триглицериди с участието на имобилизирана липаза.

Фиг. 4-42. Пример за приложение на имобилизирана холестерол оксидаза и пероксидаза при определяне съдържанието на холестерол.

Имобилизираните ензими се използват и във фармацевтичната промишленост като високо специфични катализатори. Например имобилизирана b-галактозидаза се използва за намаление съдържанието на лактоза в млякото за хора, които страдат от заболяването лактозна непоносимост. Стереоспецифични имобилизирани ензими се използват за бързо и икономично промишлено превръщане на евтин предшественик в хормона преднизолон чрез хидроксилиране и дехидрогениране.

4.4.10 Приложение на реакцията "антиген-антитяло" в клиничния анализ - пример за определяне белтъците на вируса на СПИН чрез метода ELISA

Съкращението ELISA идва от английското название на метода: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay.
Свързването на индикаторен ензим (напр. пероксидаза) със специфично антитяло срещу белтъчен антиген, напр. от вируса на СПИН (HIV) позволява провеждане на изключително специфично и чувствително определяне на белтъците на този вирус. Пероксидазата се използва да катализира получаването на цветен продукт, който се спектрофотометрира и който е пропорционален на количеството на антигена в пробата.

При описание принципа на метода ELISA се използват означенията, дадени на фиг. 4-43-1:

Фиг. 4-43-1. Означения, използвани при определяне белтъка от обвивката на вируса на СПИН чрез метода ELISA.

Показан е по-често използваният вариан на метода, при който белтъкът (в случая от обвивката на вируса на СПИН) първо се свързва към специално приготвено специфично за този белтък антитяло А1. Второто антитяло А2 се свързва ("бележи") с индикаторен ензим, който катализира превръщането на безцветно багрило в цветен продукт.

Тестът за вируса на СПИН се извършва в полистиренови плаки с малки вдлъбнати цилиндърчета по начина, описан на фиг. 4-43-2.

Фиг. 4-43-2. Определяне на белтъка от обвивката на вируса на СПИН чрез метода ELISA.

Последователно се извършват следните операции:
1) получаване на А1, А2 и комплекса А2-Е.
2) инкубиране серума на пациента с подготвените антитела в реда, показан на фиг. 4-43-2, до получаване на четворен комплекс (Б-А12-Е). След всяко инкубиране несвързаните антитела се отмиват.
3) цветна реакция, катализирана от свързания Е.
4) спектрофотометриране на цветния продукт, чиято екстинкция е пропорционална на количеството на вирусния белтък Б.
Каталитичното действие на свързаната пероксидаза позволява измерването на много ниски количества от вирусния белтък.

4.5 Насоки за самостоятелна работа

4.5.1. Проиграйте теста Ензими в желан от Вас режим.

4.5.2. Симулация на клиничен случай
Изберете симулацията на клиничния случай
"Васил".

4.6 Литература

1. Рапопорт С. М. (1966) Медицинская биохимия, Изд. "Медицина", Москва, стр. 144 (перевод с немецкого).
2. Николов,Т. (1995) Ензими, в: Ангелов, А., Е. Гачев, К. Данчева, А. Кръшкова, Т. Николов, Л. Сираков, Биохимия за медици и стоматолози, 1995, Университетско издателство "Св. Климент Охридски", София, стр. 81-127.
3. Enzyme nomenclature (1992) Recommendations of IUBMB committee, San Diego, New York, london, Sidney, Tokyo, Toronto, Academic Press или Systematic names and EC nomenclature numbers: http://www. expasy.org/enzyme
4. Sayle, R. http://www.metaphorics.com
5. Birktoft, J. J., Blow, D. M. J. Mol. Biol. 68, 1972, 187. The structure of crystalline alpha-chymotrypsin.
6. Bernstein, F. C., Koetzle, T. F., Williams, G. J. B., Meyer, E. F. Jr., Brice, M. D., Rodgers, J. R., Kennard, O., Shimanouchi, T. & Tasumi, M (1977). J. Biol. Chem. 112, 535, Protein Data Bank. A computer-based archival file for the macromolecular structures .
7.Страйер, Л. Биохимия, Пер. с англ. Мир, 1985, т. 2, стр. 275.
8. Becker, M. A., Kostel, P. J. Meyer, L. J. and Seegmiller, J. E. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1973, 2749. Human phosphoribosylpyrophosphate synthetase: increased enzyme specific activity in a family with gout and excessive purine synthesis
9. Burnell, J. C., Carr, L. G., Dwulet, F. E., Edenberg, H. J., Li, T. -K and Bosron, W. F. Biochem. Biophys. Res. Commun. 146, 1987, 1227. The human b3 alcohol dehydrogenase subunit differs from b1 by a cys- arg-369 substitution which decreased NAD(H) binding.
10. Crabb, D. W. Edenberg, H. J., Bosron, W. F. and Li, T. -K.J. Clin. Invest. 83, 1989, 314. Genotypes for aldehyde dehydrogenase deficiency and alcohol sensitivity.
11. Sperling, O., Persky-Brosh, S., Boen, P. and DeVries, A. Biochem. Med. 7, 1973, 389. A human erythrocyte phosphoribosylpyrophosphate synthetase mutationally altered in regulatory properties.
12. Webb, J., C. Thompson (1992) Thrombolysis for acute myocardial infarction. Can. Fam. Physician 38, 1415.

Биоенергетика

Цели

Цели на преподавателя:
1. Да се разгледат биологичното окисление и спрегнатото с него окислително фосфорилиране, чрез които енергията на химични връзки в различни вещества се освобождава и акумулира в макроергични съединения, за да се използва за осигуряване на жизнените процеси;
2. Да се опише свободното окисление, ролята му за топлопродукция, за детоксикация и в метаболизма, както и получаването и обезвреждането на реактивни производни на кислорода;
3. Да се дадат примери за ползата от тези познания за клиничната практика.

След работа с този раздел студентите ще могат да постигнат следните учебни цели:

А. Знания
1. Да дефинират понятието макроергични съединения и да дадат примери за различни видове макроергични съединения;
2. Да знаят що е биологично окисление и какви видове има;
3. Да дават примери за субстрати на биологичното окисление и за крайни акцептори на редуциращи еквиваленти;
4. Да дефинират понятията оксидо-редукция, редокс-системи и да изброят редокс-системите с биологично значение;
5. Да дадат определение за окислително фосфорилиране на сустратно ниво и в дихателната верига;
6. Да дадат определение за оксидо-редоксази;
7. Да опишат особеностите на дехидрогенази, оксидази, оксигенази и хидроксипероксидази и дадат пример за реакция, катализирана от тях;
8. Да изброят редокс-системите с биологично значение и да посочат каква е тяхната роля
9. Да дадат примери за процеси на субстратно фосфорилиране;
10. Да опишат структурата и функциите на пируватдехидрогеназния комплекс;
11. Да дадат определение за дихателни вериги;
12. Да посочат компонентите на дихателната верига и принципа на подреждането им между субстрата и кислорода;
13. Да посочат значението и компонентите на електрон-пренасящите вериги в ендоплазмения ретикулум и да дадат примери за такива вериги;
14. Да посочат активните производни на кислород и начините за тяхното обезвреждане;
15. Да посочат значението на цитратния цикъл за катаболизма и анаболизма;
16. Да знаят кои витамини са необходими за протичане на цитратния цикъл;
17. Да посочат кои са анаплеротичните реакции за цитратния цикъл.

Б. Разбирания
1. Да разбират и обяснят особеностите на живите организми като отворени системи;
2. Да обяснят значението на системата АТФ/АДФ за енергийната обмяна в клетките;
3. Да обяснят действието и значението на ензима трансхидрогеназа;
4. Да разбират и обяснят разликата между анаеробни и аеробни дехидрогенази;
5. Да посочат приликите и разликите между НАД и НАДФ и да обяснят биологичната им роля;
6. Да обяснят ролята на окислителното фосфорилиране на глицералдехид-3-фосфат;
7. Да обяснят ролата на енолазната реакция;
8. Да обяснят ролята на окислителното декарбоксилиране на a-кетокиселините пируват и a-кетоглутарат;
9. Да обяснят ролята на витамините В1, В2, РР и пантотенова киселина за окислителното декарбоксилиране на a-кетокиселините;
10. Да обяснят механизма на топлопродукцията и ролята на термогенин;
11. Да представят метаболитната и енергийна равносметка при разграждане на една молекула ацетил-КоА в цитратния цикъл;
12. Да обяснят значението на анаплеротичните реакции за цитратния цикъл.

В. Умения
1. Да свържат предишни познания върху нуклеотиди и кофактори с новите познания върху биологични редокс-системи, за да представят с формули как протича редокс-процес между субстрат и редокс-системи като НАД, НАДФ, ФМН, ФАД, КоQ;
2. Да представят с формули молекулния механизъм на окислителното фосфорилиране на глицералдехид-3-фосфат;
3. Да представят с формули молекулния механизъм на окислителното декарбоксилиране на a-кетокиселините пируват и a-кетоглутарат;
4. Да демонстрират значението на експериментите с инхибитори на електронния транспорт за установяване подреждането на компонентите на дихателната верига;
5. Да прилагат хемиосмотическата хипотези за механизма на окислителното фосфорилиране за да обяснят действието на разпрягащи агенти и инхибитори на окислителното фосфорилиране;
6. Да демонстрират ролята на НАДФН за обезвреждане на свободните радикали, производни на кислород;
7. Да представят с формули химизма на цитратния цикъл;
8. Да демонстрират връзките на цитратния цикъл с дихателните вериги;
9. Да демонстрират ролята на витамините за протичане на цитратния цикъл;
10. Да демонстрират регулацията на цитратния цикъл.

5.1.-5.1.1. Особености на живите организми от термодинамична гледна точка: резюме

Първият закон на термодинамиката (Енергията остава постоянна) и вторият закон (Спонтанните процеси увеличават безпорядъка във вселената) са приложими за биохимичните процеси.

От промяната в свободната енергия (DG = DH - TDS) може да се определи дали реакцията протича спонтанно.
Ако DG < 0, реакцията е спонтанна и екзергонична. Ако DG << 0, реакцията отива до край и е необратима. Реакции, близко до равновесието, са лесно обратими.
Ако DG > 0, реакцията е ендергонична и протича само, ако в системата се внася енергия.
Ако DG = 0, системата е в равновесие и не се извършва никаква промяна.

Промяната в стандартната свободна енергия за даден процес (DGo') може да се изчисли от неговата експериментално определяна равновесна константа.

За окислително-редукционни процеси DGo' се изчислява от разликата в нормалните редокс-потенциали на реагиращите вещества (DGo' = - nF DEo').

Живите организми са отворени системи. Затова при тях има важни особености:
1) Поради непрекъснато извличане на продуктите на реакциите в следващи реакции не се достига до термодинамично равновесие, а се установява стационарно състояние, при което се отделя енергия и може да се извършва работа.
2) Като източник на енергия те могат да ползват само химичната енергия, отделяна при окислителни екзергонични катаболитни процеси. Топлинната енергия не може да бъде изолзвана.
3) Ендергонични процеси в организмите протичат за сметка на енергия, отделена при екзергоничните процеси и съхранена в макроергични връзки. Т.е. спрягането между екзергоничните и ендергоничните процеси става чрез макроергични съединения.

Макроергични връзки са тези, при чието хидролитно разграждане DGo' е най-малко 30 kJ/mol до 70 kJ/mol. При хидролитно разграждане на нормоергични връзки DGo' е от 8 до 21 kJ/mol.

Адениловата система (АТФ/АДФ) е най-често използваният посредник между екзергоничните и ендергонични процеси. Синтезата на АТФ от АДФ и неорганичен фосфат за сметка на енергия от окислителен процес се означава като окислително фосфорилиране. Разграждането на АТФ до АДФ и Ф или до АМФ и пирофосфат осигурява с енергия различни ендергонични процеси (активиране на субстрати, биосинтези, мускулно съкращение, осмотична работа и пр.)

Макроергичните връзки в АТФ и АДФ са пирофосфатни.
Други видове макроергични съединения, предшественици на АТФ, са метаболити от важни обменни пътища: фосфоенолпируват и 1,3-бисфосфоглицерат от гликолиза, различни ацил-КоА - метаболити от разграждане на мастни киселини, креатин фосфат - резервно макроергично съединение в мускулите и др.
АТФ не е най-богатото на енергия макроергично съединение. DGo' при хидролиза на АТФ има междинна стойност спрямо другите макроергични и нормоергични съединения. Тази междинна стойност определя централната роля на адениловата система в енергетичната обмяна. Тя позволява на АДФ да поема енергия от други макроергични съединения, предшественици на АТФ, а полученият АТФ да отдава енергията на различни нормоергични съединения, за да ги активира.

5.1.2 Общи закони на термодинамиката (кратък преговор)

Всеки жизнен процес е съпътстван от енергетични трансформации. Биоенергетиката, или биохимичната термодинамика, е тази част от биохимията, която изучава енергетичните промени, придружаващи биохимичните реакции.

Живите организми се подчиняват на общите закони на термодинамиката, но тъй като са отворени системи, при тях има важни особености.
Първият общ закон за запазване на енергията гласи, че при всяка физична или химична промяна общата енергия на системата и обкръжаващата я среда остава постоянна.
Вторият общ закон гласи, че Вселената се стреми към безпорядък.
От тези закони произтичат важни следствия:
1) Химичните процеси се провеждат в посока към равновесието и се преустановяват, когато то е достигнато.
2) Всички реални процеси протичат с увеличение на ентропията.

За затворени системи е в сила равенството:

DG = DH - T DS                         (5.2.1)

или в условията на биохимичните реакции:
DG = DЕ - T DS                        (5.2.2)

където
DG - промяна в свободната енергия, т.е тази част от общата енергетична промяна в системата, която се използва за полезна работа;
DH - промяна в енталпията (топлинното съдържание);
DЕ - тотална промяна във вътрешната енергия на реакцията;
DS - промяна в ентропията;

5.1.3 Използваема енергия и промени в ентропията

Източник на енергия за човека и животните е само химическата енергия, отделяна при разграждане на химични връзки на различни вещества (горива) в окислителни процеси в хода на катаболизма. Фотосинтезиращите организми ползват директно слънчева енергия. Топлинната енергия не може да се използва от живите организми за полезна работа.

При тях може да се извършва работа и да настъпват промени в свободната енергия, без да се увеличава ентропията. Тя може да остава постоянна или дори да намалява, за сметка на процеси, настъпващи в околната среда. Това не противоречи на втория термодинамичен закон, ако приемем организма и околната му среда за една обща затворена система.

5.1.4 Стационарно състояние, а не термодинамично равновесие

Химичните реакции в отворените системи рядко достигат до равновесно състояние. Те протичат постоянно еднопосочно. Равновесието не може да се достигне, защото продуктите на реакцията се извличат непрекъснато. Ако скоростите, с които протичат реакциите в една метаболитна верига, са еднакви, концентрациите на междинните метаболити остават постоянни за даден период от време - настъпва състояние на привидно равновесие, което се различава от термодинамичното и се означава като стационарно състояние. В това състояние при привидно равновесие, системата може постоянно да отделя свободна енергия, т.е. да извършва работа.

5.1.5 Спрягане на екзергонични и ендергонични реакции в организма

В организма се извършват два типа противоположни, но взаимозависими процеси (фиг. 5-1).

1) процеси, които доставят енергия - те са окислителни, катаболитни и екзергонични. Такива процеси са напр. гликолиза, b-окисление на мастни киселини и пр., окислението в дихателната верига и др. Усилват се при гладуване и стрес.

2) процеси, които се нуждаят от енергия - те са редукционни, анаболитни и ендергонични. Такива процеси са биосинтезите, мускулното съкращение, нервното възбуждение, осмотична работа, клетъчно деление и др. Усилват се, когато има акумулирана енергия, излишъци от субстрати и в периоди на растеж и регенерация на тъкани.

Обединяването или спрягането на тези два противоположни типа процеси става чрез макроергични (богати на енергия) вещества. В тях освободената при екзергоничните процеси енергия се акумулира в биологично използваема форма - в особени макроергични връзки (виж т. 5.1.6), чрез чиято енергия се осигуряват ендергоничните жизнени процеси.

  Фиг. 5-1. Спрягане на процесите, доставящи и консумиращи енергия чрез макроергични съединения (по Николов [1].

В живите организми едновременното или последователно протичане на ендергонична и екзергонична реакция с общ метаболит осигурява протичането на ендергоничната реакция. Например в реакцията

глюкоза + Ф <======> глюкозо-6-фосфат + H2O      DG1o' = + 13.8 kJ/mol

Тази реакция е ендергонична и не може да протече. Ако едновременно с нея се извърши екзергоничната реакциия

АТФ + H2O <=====> АДФ + Ф       DG2o' = - 30.5 kJ/mol

то цялостната спрегната реакция ще бъде екзергонична:

глюкоза + АТФ <====> глюкозо-6-фосфат + АДФ
DGo' = + 13.8 - 30.5 = - 16.7 kJ/mol

В отворени системи една ендергонична реакция може да протече, и ако продуктът се изтегля в следваща силно екзергонична реакция (виж напр. т. 5.3.4).

5.1.6 Макроергични съединения - определение, значение и видове

Макроергични връзки са тези, при чието хидролитно разграждане промяната на стандартната свободна енергия DGo' e най-малко 30 кJ/mol (до 70 кJ/mol). При хидролитно разграждане на обикновени ковалентни връзки като естерни, гликозидни, пептидни (нормоергични връзки) DGo' e от 8 до 21 кJ/mol. Макроергичните връзки се отбелязват със символа ~.

Макроергичните съединения се оприличават на акумулатор - способен да се зарежда с енергия от различни генератори, а от своя страна може да снабдява с енергия различни системи и процеси (фиг. 5-2-1). Ролята на такъв унифициран акумулатор се изпълнява най-вече от адениловата система АДФ/АТФ, позната от глава 3. Зареждането се състои в синтеза на АТФ от АДФ и Ф (или фосфорилиране на АДФ с Ф до АТФ) за сметка на енергия, отделена при окислителен процес. Затова този процес се нарича окислително фосфорилиране. Изпразването на акумулатора се състои в разграждане на АТФ до АДФ и Ф. В някои случаи АТФ се разгражда до АМФ и пирофосфат (ФФ) и това придава допълнителна гъвкавост на адениловата система в нейните функции на посредник между екзергоничните и ендергоничните процеси.

Фиг. 5-2-1. Адениловата система (АДФ/АТФ) - посредник между екзергоничните и ендергоничните процеси. Окислително фосфорилиране е синтеза на АТФ от АДФ и неорганичен фосфат (Ф), за сметка на енергия, отделена при окислителен процес. Разграждането на АТФ до АДФ и Ф или до АМФ и пирофосфат (ФФ) осигурява протичането на ендергоничните процеси.

Макроергичните връзки в АТФ и АДФ са пирофосфатни (фиг. 5-2-2). В АТФ и в останалите нуклеозидтрифосфати има три фосфатни връзки: a, b и g. Първата е обикновена естерна, а останалите две са макроергични (пирофосфатни). Най-често за работа се използва енергията на g-връзката, и по-рядко тази на b-връзката. В АДФ и в останалите нуклеозиддифосфати има една макроергична пирофосфатна и една естерна връзкa.

Фиг. 5-2-2. Пирофосфатни макроергични връзки в АТФ и АДФ.

Конкретни примери за други видове макроергични съединения са дадени в табл. 5-1. Посочена е ролята им в обмяната. Тук спадат фосфоенолпируват, 1,3-бисфосфоглицерат, креатин фосфат, различни ацил-КоА и други. Дадени са и стойностите на промяната в стандартната свободна енергия (DGo') при хидролиза на тези съединения.

Табл. 5-1. Важни метаболити, съдържащи макроергични връзки*.

Макроергични
съединения
Макроергична връзка
DGo'
kJ/mol
Роля в обмяната
Фосфоенолпируват

енолфосфатна
- 61,9
метаболит от гликолиза и глюконеогенеза
1,3-бисфосфоглицерат

ацилфосфатна
- 49,3
метаболит от гликолиза и глюконеогенеза
Креатинфосфат

гуанидин-фосфатна
- 43,0
резервно макроергично съединение в мускулите
Различни ацил-КоА,
напр. ацетил-КоА

тиоестерна
- 31,4
метаболити от b-окисление и др.
нуклеозидди- и нуклеозидтрифосфати
напр. АТФ --> АМФ + Ф-Ф
 АТФ -->АДФ+Ф
пирофосфатна

- 32,2
- 30,5

активиране на огромен брой субстрати чрез фосфорилиране

 *Стойностите за DGo' са по Montgomery et al., 1996 [2], Harper et al., 1996 [3] и Lehninger et al., 1993 [4].

5.1.7 Хидролиза на АТФ при физиологични условия

При стандартни условия DGo' за реакцията

АТФ + Н2О --> АДФ + Ф

e - 30.5 KJ/mol (табл. 5-1). В живите клетки физиологичните концентрации на АТФ, АДФ и Ф не са 1 mol/L, а обикновено 5, 4 и 2.1 mmol/L, съответно. Концентрацията на водата при стандартни и физиологични условия се приема за единица в разредени разтвори. Замествайки тези стойности в ур. 5.2.3, за DG се получава стойността - 42.7 KJ/mol, което е значително над стойността (-30.5 KJ/mol), изчислена при еквимоларни концентрации.

DG = DGo + RT ln [AДФ] [Ф]  /  [АТФ]  [Н2О] =
 = -30.5 + 1.98 (273+30) 2.303 log [(4 x 10-3) (2.1 x 10-3) / 5 x 10-3] =
 = - 42.7 KJ/mol

Фосфорната киселина се намира на различни енергетични нива в организма. Свободната фосфорна киселина е на нулево енергетично ниво. Естерно-свързаната фосфорна киселина е на нормално енергетично равнище (нормо-равнище). Изграждащата макроергични връзки фосфорна киселина е на високо енергетично равнище. При окислителното фосфорилиране фосфат се издига от нулево до високо равнище. При хидролиза на АТФ до АДФ и Ф фосфатната група преминава обратно от високо на нулево ниво. При активиране на субстрати, напр. в реакцията

АТФ + глюкоза ---> АДФ + глюкозо-6-Ф

фосфатната група се пренася от високо ниво на нормоергично ниво.

5.1.8 Централна роля на адениловата система за енергетичната обмяна в клетките

От табл. 5-1 в т. 5.1.6. се вижда, че АТФ не е най-богатото на енергия съединение - промяната в стандартната свободна енергия DGo' при хидролиза е значително по-ниска от тази за други макроергични съединения. Но адениловата система има централна роля в биоенергетиката, именно поради междинната стойност за DGo' спрямо другите макроергични съединения и нормоергичните съединения. Тази междинна стойност позволява АДФ да поема енергия от други макроергични съединения - предшественици на АТФ, а полученият АТФ да отдава енергия на различни нормоергични съединения, за да ги активира (фиг. 5-3). Креатин фосфат е резервно макроергично съединение в мускулите.

Фиг. 5-3. Централна роля на адениловата система АТФ/АДФ за енергетичната обмяна в клетките.

Има и друга важна причина за централната роля на адениловата система в клетъчната биоенергетика. Макар че АТФ е добър донор на фосфатна група, той е кинетически стабилен. Поради високата активираща енергия (200-400 kJ/mol) за некаталитично разкъсване на фосфоанхидридните връзки, АТФ не отдава спонтанно фосфатна група на водата или на стотици други потенциални акцептори. Преносът на фосфатна група се извършва само в присъствието на специфични ензими. Регулирайки тези ензими, клетката може да регулира преноса на енергия, осъществяван от АТФ.

5.2.-5.2.1. Биологично окисление: резюме

В живите организми, както и в неживата природа, окислението (отделяне на електрони) винаги се съпътства от редукция (приемане на електрони). Редокспотенциалът, изразяван чрез уравнението на Нернст, е количествен израз на афинитета на веществата към електроните. При редокс-процеси електроните се придвижват от редокс-система с по-нисък редокс-потенциал към редокс-система с по-висок редокс-потенциал.

Клетки, които изискват кислород като електронен акцептор при окислението, имат аеробен метаболизъм, а тези, които не използват кислород, имат анаеробен метаболизъм. Аеробният метаболизъм се състои от три фази:
1) разграждане на биополимери в храносмилателния тракт до мономери. В тази фаза няма окислителни реакции, не се синтезират макроергични съединения.
2) превръщане на мономерите в ацетил-КоА. Отделни разградни реакции на различни субстрати са окислителни (субстратно окисление). Синтезата на АТФ за сметка на енергия от субстратно окисление се означава като субстратно фосфорилиране.
3) разграждане на ацетил-КоА в цитратния цикъл до СО2 и Н2О.
Водородът, отделен от метаболити на цикъла, попада в дихателната верига. При окислението му в нея се отделят значителни количества енергия, която се акумулира в АТФ.
Биологичното окисление се отличава със следните особености:
1) То се катализира от оксидо-редуктази, които го ускоряват, придават му специфичност и възможност за регулация. Тези ензими са двукомпонентни - действат съвместно с редокс-системи.
2) В повечето случаи водородът или електроните, отделени от субстратите на биологичното окисление, не достигат директно до кислорода или друг краен акцептор. Това става постепенно и многостъпално, в поредица от реакции под действие на ензими с техните редокс-системи с нарастващ редокс-потенциал.
3) Поради това енергията се отделя също на порции, а не експлозивно и може да се съхрани в макроергични съединения.
4) В по-редки случаи кислородът участва директно в окислителни реакции без освободената енергия да се акумулира в макроергични съединения. Освен метаболитно значение, тези реакции имат значение и за топлопродукцията.

Оксидо-редуктазите се делят на четири групи:

1) анаеробни дехидрогенази, катализиращи съвместно с никотинамидни или флавинови редокс-системи окисление на субстрати или окисление в дихателната верига. Тук спадат и анаеробните транселектронази (цитохроми).

2) аеробни оксидази, които използват кислород за акцептор на водорода, отделен от субстратите, при което се получава:
а) Н2О (цитохром с оксидаза, крайният ензим в дихателната верига) или
б) Н2О2 (аминоацидооксидази, ксантин оксидаза и др.).

3) оксигенази:
а) монооксигенази, които хидроксилират неспецифично лекарства и други чужди за клетката вещества с цел обезвреждане или катализират стереоспецифични хидроксилирания в биосинтезата на различни стероиди и
б) диоксигенази, които вмъкват 2 атома кислород в ароматни пръстени, последвано от окислително разтваряне на пръстена (хомогентизинат оксидаза).

4) хидрокспероксидази (пероксидази, каталаза) - обезвреждат токсични прекиси и получаващите се от тях свободни радикали, които увреждат белтъци, нуклеинови киселини, мембрани.

Към редокс-системите с биологично значение спадат:

1) Никотинамидни
Те са със сравнително нисък редокс-потенциал. Като кофактори на анаеробни дехидрогенази лесно дехидрогенират стотици различни субстрати. НАДН предава водорода в дихателната верига, а НАДФН - за редукционни биосинтези.

2) Флавинови
Те са с по-висок редокс-потенциал от никотинамидните и са коензими или простетични групи на свързаните с дихателната верига дехидрогенази и на някои оксидази. Освен напълно редуцирана и окислена форма, имат и семихинонова форма, с което улесняват прехода от дву- към едноелектронен пренос.

3) С хинонова структура
KoQ (убихинон) е хидрофобен мобилен компонент на дихателната верига. Напълно редуцираната и окислената форми не са свързани с белтък. Семихиноновата форма е прикрепена към Q-свързващ белтък във вътрешната митохондрийна мембрана.

4) Метал-съдържащи:
Тук спадат железни и медни йони, свързани към белтъчен компонент, Fe-S белтъци и различни хемове - простетични групи на цитохроми. Осъществяват едноелектронен пренос в дихателната верига и в електронопреносителни вериги в ендоплазмения ретикулум.

5) С тиолови групи:
Тези редокс-системи (липоева киселина и глутатион) в окислената си форма съдържат дисулфиден мост, а в редуцираната - сулфхидрилни групи. Липоат е простетична група на дихидролипоил трансацетилаза от окислителното декарбоксилиране на a-кето киселини. Глутатион е добър редуктор и наред с НАДФН участва в процеси на обезвреждане на токсични радикали.

6) Аскорбинова киселина (витамин С)
Това съединение е важен анти-оксидант, необходим за обезвреждане на токсични свободни радикали.

5.2.2 Дефиниция на основни понятия

За биологичното окисление е валидна дефиницията за окислително-редукционен процес, в който при окисление от веществата се отделят електрони, а при редукция веществата приемат електрони (вж табл. 5-2).

Табл. 5-2. Термини, използвани при описание на редокс-процеси.

Термин
Дефиниция
окисление процес, при който от веществата се отделят електрони
редукция процес, при който веществата приемат електрони
окислител вещество, което приема електрони и се редуцира
редуктор вещество, което отделя електрони и се окислява
редокспотенциал E количествен израз на афинитета на веществата към електроните. Зависи от концентрацията на веществата и температурата: Е = Eo + ( RT/nF)  ln [Aок] / [Аред].
Еo' - стандартен редокс потенциал на системата при рН 7,0.
редокс-система състои се от окислената и редуцираната форма на едно вещество
посока на придвижване на електроните При редокс-процеси електроните се придвижват от вещество с по-нисък към вещество с по-висок редокспотенциал.

5.2.3 Стадии в катаболизма

Клетките, които използват кислород като електронен акцептор за генериране на енергия, имат аеробен метаболизъм, а тези, които не използват кислород, имат анаеробен метаболизъм. Аеробният метаболизъм се състои от три стадия (фази) (Х. Кребс) - виж фиг. 5-4.

  Фиг. 5-4. Общ поглед върху катаболизма на основните горива и синтезата на АТФ в окислителното фосфорилиране.

При човека в първата фаза, означавана като подготвителна, приетите с храната биополимери се хидролизират до мономери в храносмилателния тракт. Отделената свободна енергия е незначителна и не се акумулира в макроергични съединения.

Във втората фаза мономерите (хексози, мастни киселини и аминокиселини) се превръщат във все по-прости молекули, докато се получи ацетил-КоА и други метаболити от цитратния цикъл. В тази фаза отделни реакции са окислителни. Те протичат като пряко едностъпално анаеробно дехидрогениране на субстратите. Това именно анаеробно дехидрогениране на стотици различни субстрати по пътя на тяхното разграждане в хода на катаболизма се означава като субстратно окисление. Използват сe и термините окисление на субстратно ниво или окисление в субстратната верига.
Синтезата на АТФ за сметка на енергия от субстратно окисление се означава като субстратно фосфорилиране.

В третата фаза ацетил-КоА (с 2 атома) се разгражда до СО2 в цикъла на Кребс, който е крайният общ метаболитен път с изключително значение за катаболизма. В него има окислително-редукционни реакции, чрез които отделеният от субстратите водород попада в дихателните вериги. В тези вериги електроните се пренасят към кислорода и се получава вода.

При окислението в дихателни вериги се отделят значителни количества енергия, която се акумулира в АТФ. Окислителното фосфорилиране в дихателната верига дава около 75 %, а субстратното фосфорилиране около 25 % от АТФ в клетките.

5.2.4 Особености на биологичното окисление

Биологичното окисление се отличава от окислението в неживата природа с някои свои важни особености.

1) Биологичното окисление се катализира от ензими от група I (оксидоредуктази), които го ускоряват, придават му специфичност и възможност за регулация според нуждите на организма. Всички оксиредуктази (т. 5.2.5) са двукомпонентни и действат съвместно с редокссистеми (вж т. 5.2.6). Многобройни съединения с разнообразни химични групи се явяват техни субстрати (табл. 5-3), както ще проличи при изучаване на конкретните катаболитни пътища в следващите глави. Отделените от субстрата водород или електрони се пренасят върху краен акцептор. При аеробни условия краен акцептор е кислородът, който се редуцира до вода. При анаеробни условия краен акцептор е друго вещество, напр. пируват, който се редуцира до лактат, или ацеталдехид, който се редуцира до етанол.

Табл. 5-3. Примери за субстрати на биологичното окисление.

I. Субстрати, не взаимодействащи пряко с кислород

Субстрат
Окислявана група
Продукт
Участие в катаболитен път
малат
b-хидроксиацил-КоА
- ОН
- ОН
оксалацетат
b-кетоацил-КоА
цитратен цикъл
b-окисление
глицералдехид-3-Ф

a-кетоглутарат

- CHO
или
>С=О
1,3-бисфосфоглицерат

сукцинил-КоА

гликолиза

цитратен цикъл

сукцинат
-СН2-СН2-
фумарат цитратен цикъл

аминокиселини

-NН2
a-кетокиселини окислително
дезаминиране

II. Субстрати, взаимодействащи пряко с О2

Субстрат
Вид на реакцията
Продукт
Участие в катаболитен път
фенилаланин
хидроксилиране
тирозин
разграждане на фенилаланин
хомогентизинат
оксигениране
фумарил-
ацетоацетат
разграждане на фенилаланин

2) В неживата природа взаимодействието на веществата с кислорода е директно и съпроводено с отделяне на огромно количество топлина. Напр. в т.н. реакция на гърмящия газ при свързване на водород и кислород, температурата се повишава до 3000 оС.

Обратно, при биологичното окисление водородът или електроните, отделени от субстратите, не достигат до крайния акцептор директно, а постепенно многостъпално, минавайки в поредица от реакции, катализирани от ензими с техните редокс-системи с последователно нарастващи редокс-потенциали.

3) Всеки пренос на водород (електрони) от редокс-система с по-нисък към редокс-система с по-висок редокспотенциал е екзергоничен процес, т.е. съпроводен е с отделяне на свободна енергия. Тази енергия не се отделя наведнъж, а на порции в отделните стъпала на дихателните вериги. Само първата порция остава пряко свързана с окислението на субстрата - т.е. в субстратната верига. Това постепенно (на порции) освобождаване на енергията в стъпалата на дихателните вериги позволява максимална част от нея да бъде превърната в макроергични съединения - в дихателните вериги се получават няколко мола АТФ при окисление на 2 Н атома, отделени от субстрата. Това не би било възможно, ако енергията се отдели наведнъж при пряко свързване на субстрата с кислород. Организацията на окислителното фосфорилиране може да се сравни с каскадното използване на енергията на водния пад. Стъпаловидното спускане и извличане на енергия от всяко стъпало (каскада) е по-изгодно, отколкото ако водата се пусне от голяма височина еднократно.

5.2.5.-5.2.5.1. Ензими, осъществяващи биологичното окисление: дехидрогенази

Оксидоредуктазите се разделят на четири групи: дехидрогенази, оксидази, оксигенази и хидроксипероксидази.
Всички ензими от голяма група на дехидрогеназите са анаеробни, т. е. не могат да използват кислород като акцептор на водорода. Специфични са по отношение на субстрата и участват както в субстратното окисление, така и в дихателната верига. В зависимост от редокс-системата, с която действат, има :

1) Дехидрогенази с никотинамидни редокс-системи, например малат дехидрогеназа катализира реакцията:


малат + НАД+ ------> оксалацетат + НАДН + Н+

Тези ензими катализират пренос на 1 Н и 1 е- (хидриден йон)

2) Дехидрогенази с флавинови редокс-системи, например сукцинат дехидрогеназа катализира реакцията:


сукцинат+Е-ФАД -------->фумарат + Е-ФАД.Н2

Обикновено дехидрогеназните реакции са обратими поради малката разлика в редокспотенциала между субстрата и редокс-системата. Никотинамидните редокс-системи са слабо свързани с апоензима, докато връзката между него и флавиновите редокс-системи е много по-здрава, дори ковалентна в някои случаи.

3) Анаеробни транселектронази, катализиращи пренос на един електрон.
Тук спадат цитохромите от дихателната верига (без цитохром аа3), например цитохром с редуктаза катализира реакцията:


цит. 1 (Fe2+) + цит. c (Fe3+) -----> цит. 1 (Fe3+) + цит. с (Fe2+)

Транселектронази са също и цитохромите в електрон-пренасящите вериги в ендоплазмения ретикулум (виж т. 5.6.3).

5.2.5.2 Оксидази

Оксидазите са аеробни - използват кислород за акцептор на водорода, отделен от субстратите, при което се образува вода или водороден прекис. Към оксидазите спадат:
1) Цитохром с оксидаза (цитохром аа3)
Този ензим съдържа хем като простетична група и медни йони. Това е крайният ензим в дихателната верига, предаващ електроните от цитохром с към кислорода, при което заедно с протони се образува вода:


4 цит.с (Fe2+) + 4Н+ + О2  -----> 2 H2O + 4 цит.с (Fe3+)

2) Останалите оксидази, наричани също аеробни дехидрогенази, не са свързани с дихателните вериги. Те съдържат най-често ФМН или ФАД като простетични групи, т.е. са флавопротеини. Катализират пренос на два водородни атомa от субстрата директно към кислород, при което се получава водороден прекис вместо вода. Отделената при окислението на субстрата енергия се разсейва като топлина. АТФ не се получава. Към оксидазите-флавопротеини спадат D-и L- аминоацидо оксидази (виж фиг. 4-6 и глава 8), ксантин оксидаза (фиг. 4-29 и глава 9), алдехид дехидрогеназа, глюкозо оксидаза.

5.2.5.3 Оксигенази

1) Монооксигенази или хидроксилази
Те катализират вмъкването на един атом кислород в субстрата, при което се получава алкохолна или фенолна група. Другият кислороден атом се редуцира до вода от друг донатор на водород:

R-H + O2 + R1-H2   ------> R-OH + Н2О + R1

Тези ензими са част от електрон-пренасящите вериги в ендоплазмения ретикулум в черния дроб, които неспецифично хидроксилират попадналите в клетките лекарствени и други чужди вещества с цел обезвреждане (виж т.5.6.3). Митохондрийните хидроксилазни системи в стероидогенни тъкани катализират стереоспецифични хидроксилирания в биосинтезите на стероидни хормони, витамин D, жлъчни киселини и др.

2) Диоксигенази
Това са ензими, които вмъкват два атома кислород в ароматни пръстени (пероксид), последвано от окислително разтваряне на пръстена. Такива ензими участват при разграждане на аминокисeлини - напр. хомогентизинат оксидаза от обмяната на фенилаланин и тирозин (глава 8).

5.2.5.4 Хидроксипероксидази

Тези ензими катализират разграждането на вредните за организма прекиси и получаващите се от тях свободни радикали (т.5.6.4.), които увреждат белтъците, нуклеиновите киселини, мембраните и водят до рак и атеросклероза. Прекисите се редуцират под действие на различни редуктори като аскорбат, цитохром с, хинони и др. Тук спадат:
1)Пероксидази
Те катализират обезвреждане на Н2О2:


Н2О2+ АН2  -----> 2 Н2О+ A

2) Каталаза
Тя катализира следната реакция:

Н2О2+ Н2О2 ----------> 2 Н2О + О2

като едната молекула водороден прекис е донатор, а другата акцептор на водородни атоми (електрони).

5.2.6.-5.2.6.1. Редокс-системи с биологично значение: никотинамидни редокс-системи

Тук спадат никотинамидаденин динуклеотид (НАД+/НАДН + Н+) и никотинамидаденин динуклеотидфосфат (НАДФ+/НАДФН + Н+). Пълната структурна формула на окислените им форми е вече позната от фиг. 4-2 в т. 4.1.5. Единствената структурна разлика между двете е, че в НАДФ има допълнителна фосфатна група на 2' позиция в рибозата на адениловия нуклеотид. Функционално активна и променяща се в тази динуклеотидна структура е само никотинамидната база, която е всъщност витамин РР. НАД и НАДФ са производни на витамин РР (никотинамид).

На фиг.5-5 е представена редукцията на НАД+ и едновременното окисление на субстрат с обща формула АH2. По същия начин протича и взаимодействието на НАДФ+ със субстрати. Тези редокс-системи пренасят един Н атом и един електрон, т. е. формално хидриден йон Н-. Окислените форми съдържат положително зареден пиридинов пръстен с ароматен характер (пиридиниев йон). Редуцираните форми не са заредени и пръстенът е с хиноноподобен характер. Поради това спектрите на окислените и редуцираните форми се различават. Редуцираните форми имат максимум на поглъщане при 340 nm и това позволява чрез измерване на екстинкцията при тази дължина на вълната да се определя количеството им, а от него и активността на дехидрогеназата, катализираща реакцията съвместно с никотинамидната редокс-система.

  Фиг. 5-5. Оксидо-редукция между никотинамидна редокс-система и субстрат под действие на дехидрогеназа.

Никотинамидните редокс-системи освен близка структура, имат и много близък, при това нисък нормален редокс-потенциал (табл.5-4) - малко по-висок от този на различни субстрати, но по-нисък от този на флавиновите редокс-системи. Поради това биологичната роля на НАД+ и НАДФ+ е една и съща - като коензими на голям брой анаеробни дехидрогенази те отнемат водород от голям брой разнообразни субстрати в хода на началното субстратно окисление. Връзката между коензима и съответния апоензим е слаба. Специфичността към субстрата се определя от съответния апоензим.

Табл. 5-4. Стандартни редокс-потенциали на някои важни редокс-системи и субстрати

Редокс-система Ео' при рН 7, 25о С
(волти)
2 H+ + 2 e- <====> H2 -0.414
ацетоацетат + 2 H+ + 2 e- <====> b-хидроксибутират -0.350
НАДФ+ + 2 H+ + 2 e- <====> НАДФН + H+ -0.324
НАД+ + 2 H+ + 2 e- <====> НАДН + H+ -0.320
ФМН в НАДН-дехидрогеназа + 2 Н+ + 2 e- <====>
<====> ФМН.Н2 в НАДН-дехидрогеназа
-0.300
ФМН + 2 H+ + 2 e- <====> ФМН.Н2 -0.190
фумарат + 2 H+ + 2 e- <====> сукцинат +0.031
убихинон + 2 H+ + 2 e- <====> убихинол +0.045
цитохром b (Fe3+) + e- <====> цитохром b (Fe2+) +0.077
цитохром c1 (Fe3+) + e- <====> цитохром c1 (Fe2+) +0.220
цитохром c (Fe3+) + e- <====> цитохром c (Fe2+) +0.250
цитохром a (Fe3+) + e- <====> цитохром a (Fe2+) +0.290
цитохром a3 (Fe3+) + e- <====> цитохром a3 (Fe2+) +0.550
Fe3+ + e- <====> Fe2+ +0.772
1/2 O2 + 2 H+ + 2 e- <====> H2O +0.816

Двете редокс-системи образуват общ резервоар в клетките. Редуцираните форми обаче предават акумулирания от субстратите водород в различни направления. Съотношението НАД+/НАДН в клетките се поддържа около 1000. Затова биологичната функция на НАДН е да доставя Н за дихателната верига (катаболизъм). Съотношението НАДФ+/НАДФН е около 0.01. Затова НАДФН доставя водород за редукционни биосинтези (анаболизъм).

При необходимост специален ензим трансхидрогеназа може да пренасочва големи потоци водород от катаболитно в анаболитно направление и обратно, тъй като катализира обратимата оксидо-редукция между двете никотинамидни редокс-системи:

трансхидрогеназа
НАДФН + НАД+ <=========> НАДФ+ + НАДН
.

5.2.6.2 Флавинови редокс-системи

 Тук спадат флавинмононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД). Пълната структура на окислените форми е позната от фиг. 4-2 в т. 4.1.5. Те са производни на витамин В2 (рибофлавин). На фиг. 5-6 са представени трите редокс-форми: напълно редуцирана, семихинонова и напълно окислена. Тези редокс-системи пренасят два Н атома (електрони), но това може да става последователно, като се минава през междинна семихинонова форма, която е стабилен свободен радикал.

Кислородът, крайният акцептор на електрони в аеробните организми, може да приема само единични (несдвоени) електрони. А от метаболитите електроните се отделят по двойки. Чрез семихиноновата форма се осъществява преход между дву- и едноелектронен пренос.

Редокспотенциалът им е по-висок от този на никотинамидните редокс-системи, но по-нисък от този на цитохромите (табл. 5-4). ФМН и ФАД са коензими на анаеробни дехидрогенази от дихателната верига (флавопротеини) и на други оксидази (аеробни дехидрогенази), които предават водорода директно на О2.



Фиг. 5-6. Окислена, семихинонова и редуцирана форма на  флавинова редокс-система.

5.2.6.3 Редокс-системи с хинонова структура

 На фиг. 5-7 е представена структурата на трите форми на КоQ (редуцирана, семихинонова и окислена). Наричан е и убихинон (от английски ubi- повсеместен). KоQ.H2 и KoQ са подвижни, несвързани с белтък компоненти на дихателната верига, а семихиноновата форма е прикрепена към Q-белтък, намиращ се от двете страни на вътрешната митохондрйна мембрана. Бензохиноновото ядро и полиизопреновата странична верига му придават хидрофобни свойства и позволяват придвижването му във вътрешната митохондрийна мембрана. Като подвижен компонент в излишък, убихинон участва в преноса на електрони между неподвижно вградени компоненти на дихателната верига, а именно между флавопротеините и цитохромите (виж фиг. 5-17 в т. 5.4.2). Участва и в изпомпването на протони от матрикса към междумембранното пространство посредством т.н. Q-цикъл, описан в т. 5.4.9.

  Фиг. 5-7. Редуцирана, семихинонова и окислена форми на КоQ (убихинон). n - брой на изопреновите остатъци. При човек n = 10. Поради липса на място  страничните групи са изписани само в редуцираната форма.

5.2.6.4 Метал-съдържащи редокс-системи

 Железни или медни йони, обикновено здраво свързани с белтъчен компонент, могат да пренасят електрони:

В част от тези белтъци, освен желязо има и сяра в еквимоларни количества с желязото - наричат се Fe-S белтъци и са част от сложно устроените ензими в дихателната верига.

Други Fe-съдържащи редокс-системи са хемове. На фиг. 5-8 е дадена редуцираната форма на хема на цитохром b, който е идентичен с хема в хемоглобин и миоглобин.

Хем-съдържащи белтъци са цитохромите в дихателната верига и в електрон-пренасящи вериги в ендоплазмения ретикулум. В различните цитохроми хемовете се различават по страничните заместители и връзки с белтъчната съставка. Но общото за всички хемове в цитохромите е, че валентността на Fe-йон се мени от +2 до +3 и обратно и така се осъществява пренос на електрони. Това е съществена разлика от непроменящата се валентност на Fe2+-йон в хема на хемоглобин и миоглобин, които пренасят кислород, а не електрони.

Фиг. 5-8. Структура на хема на цитохром b (редуцирана форма).

5.2.6.5 Тиолови редокс-системи

 Тук спадат липоева киселина (липоат) (фиг. 5-9А) и глутатион (.фиг. 5-9Б).
 Липоевата киселина е тиооктанова киселина, която в редуцирано състояние има две сулфхидрилни групи - на 6 и 8 позиция. В окислено състояние възниква дисулфиден мост. Чрез карбоксилната си група липоевата киселина се свързва ковалентно към e-амино група на лизилов остатък в апоензим, т.е. активната форма на липоат е липоамид. Холоензимът (дихидролипоил трансацетилаза) е вторият ензим в тройния комплекс за окислително декарбоксилиране на a-кето киселини (виж т. 5.3.6).

Фиг. 5-9.  Редокс-системи с тиолови групи.
1 - Окислена и редуцирана форма на липоева киселина.
2 -. Окислена и редуцирана форма на глутатион.

Глутатионът е трипептид: g-глутамил-цистеил-глицин. В окислената форма две молекули глутатион са свързани чрез дисулфиден мост. Като кофактор на глутатион пероксидаза участва в обезвреждането на водороден пероксид и свободния хидроксилен радикал (виж т. 5.5.4).

5.2.6.6 Аскорбинова киселина (аскорбат)

 Тази редокс-система е в същност витамин С. На фиг. 5-10 са дадени окислената и редуцираната форми. Не се синтезира в човек и трябва да се приема редовно с храната. Витамин С е добър редуктор (Ео ' = + 0.08) и може да редуцира О2, нитрати и цитохроми а и с. Като водно-разтворим антиоксидант инхибира образуването на нитрозамини в храносмилателния тракт. Усвояването на желязо е по-добро в присъствие на витамин С. Участва във важни окислителни реакции, някои от които в катаболитни пътища (разграждане на тирозин), а други в синтезни пътища: синтеза на норадреналин, образуване на жлъчка, стероидогенеза, зреене на колаген.
Фиг. 5-10. Окислена и редуцирана форма на аскорбинова киселина.

 При недостиг на витамин С се развива скорбут с характерни признаци: кървящи венци, трудно зарастващи рани, при тежки случаи се стига до смърт. Витамин С е необходим за дейността на ензимите, които хидроксилират пролинови и лизинови остатъци в полипептидните вериги на проколаген при превръщането му в зрял колаген (виж т. 2.5.6).

5.2.7 Биологичното окисление на субстратно ниво генерира НАДН и НАДФН

Обобщавайки познанията за биологичното окисление, ясно е, че субстратното окисление е едностъпално анаеробно дехидрогениране на стотици различни субстрати под действие на специфични ензими дехидрогенази, кооперирани най-често с редокс-системите НАД++ и НАДФ+. В резултат значителни количества водород под форма на НАДН могат да постъпят в дихателната верига или под форма на НАДФН да се използват за редукционни биосинтези.

Субстратното окисление е начален етап, предшестващ окислението в дихателната верига.

Енергията, отделена при субстратното окисление, поради малката разлика в редокспотенциалите, обикновено се разсейва като топлина, тъй като не достига за образуване на 1 мол АТФ . Има само три случая, когато едновременно с окислението се извършва и акумулиране на отделената енергия в макроергично съединение и те са разгледани в следващата точка 5.3.

5.3.-5.3.1. Окислителна фосфорилиране на субстратно ниво: резюме

Сред стотиците случаи на субстратно окисление има само няколко, при които отделената енергия е достатъчна за образуване на макроергично съединение. Два от тях (окисление на глицералдехид-3-фосфат и енолазната реакция) са част от гликолизата. Протичат в цитоплазмата под действие на единични ензими. Окислителното декарбоксилиране на α-кетокиселини е по-сложен процес, катализира се от дехидрогеназни комплекси и протича в митохондриите.
Окислението на глицералдехид-3-фосфат се катализира от глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа, която свързва субстрата към цистеинова сулфхидрилна група в активния център и с коензим НАД+ осъществява окислението на алдехидната група на субстрата. Това е екзергонична реакция, при която отделената енергия не се разсейва, а се използва за създаване на тиоестерна макроергична връзка в рамките на ензим-субстратния комплекс. Освен оксидоредуктазна активност, ензимът има и трансферазна активност, чрез която прехвърля ацилния радикал върху фосфат. Получава се макроергичният продукт 1,3-бисфосфоглицерат, предшественик на АТФ. Макроергичната му фосфатна група се използва за фосфорилиране на АДФ до АТФ.
Енолазната реакция е единствената позната реакция в биосферата, при която неорганичен фосфат се издига от нормоергично на макроергично ниво. При нея без участието на външна редокс-система, енолазата катализира дехидратиране на 2-фосфо-глицерат до друг предшественик на АТФ - фосфоенолпируват (ФЕП), който е с най-висока стойност на ΔGo’ за хидролиза. Дехидратирането може да се разглежда като вътрешномолекулна оксидо-редукция, съпроводена с отделяне на енергия, която се използва за създаване на енол-фосфатната макроергична връзка. Последващият пренос на макроергичната фосфатна група от ФЕП върху АДФ е необратима реакция, тъй като тавтомеризирането на първоначално получаващия се енол-пируват до кето-пируват е силно екзергонична реакция.
Макар и със скромен количествен принос гликолитичните фосфорилирания са важни в условия на кислородна недостатъчност.
Окислителното декарбоксилиране на α-кетокиселините пируват до ацетил-КоА и на α-кетоглутарат до сукцинил-КоА са важни реакции. Първата осъществява връзката между гликолизата и цитратния цикъл, а втората е част от цитратния цикъл.
Пируватдехидрогеназният комплекс (ПДХ) се състои от три ензима и 5 кофактора: пируват дехидрогеназа (Е1) с кофактор тиамин пирофосфат (ТПФ), дихидролипоил трансацетилаза (Е2) с простетична група липоамид и външен КоА, дихидролипоил дехидрогеназа (Е3) с ФАД и външен НАД +. α-кетоглутарат дехидрогеназният комплекс се отличава от ПДХ по първите два ензима.
Организирането на ензимите в сложно устроени комплекси има следните предимства:
1) Разстоянието, което субстратите трябва да изминат между активните центрове на ензимите е по-малко, отколкото ако ензимите не са в комплекс. Това увеличава реакционната скорост.
2) Намалява се възможността междинните метаболити да реагират с други молекули в странични реакции.
3) Реакциите, катализирани от мултиензимния комплекс, се регулират координирано.

5.3.2 Разлика в редокс-потенциалите на реагиращите редокс-системи, необходима за синтеза на АТФ

Окислително фосфорилиране на субстратно ниво е синтезата на АТФ или други макроергични съединения за сметка на енергия, отделена при субстратно окисление.

При оксидо-редукционните процеси отделената свободна енергия може да се изчисли от израза (5.2.4):                      - DG = n F DEo'
където n - брой на пренасяните електрони; F = 96500 J . V-1 . mole-1; DEo' - разликата в нормалните редокс-потенциали на реагиращите редокс-системи.
Изхождайки от това, че DGo' за хидролиза на АТФ е - 30.5 KJ/mol (табл. 5-1), може да се изчисли, че за синтезата на g-фосфатната връзка на АТФ е необходимо DEo' да бъде поне 0.158 V.

В живите клетки физиологичните концентрации на АТФ, АДФ и Ф не са 1 mol/L, а обикновено 5, 4 и 2.1 mmol/L, съответно. Тогава и DGo' за хидролиза на АТФ е 42.7 KJ/mol (вж т. 5.1.7). В такъв случай DEo' на реагиращите редокс-системи трябва да бъде по-висок - около 0,2 до 0,25 v.

Сред стотиците случаи на субстратно окисление има само три случая, когато отделената енергия не се разсейва като топлина, а се акумулира в продукта на окислението, който е макроергично съединение.
Тези случаи на субстратно фосфорилиране или по-общо казано, на енергетично спрягане на субстратно ниво, са:
1) окислително фосфорилиране на глицералдехид -3-Ф;
2) окислително декарбоксилиране на a-кето киселини;
3) енолазна реакция

5.3.3 Окислително фосфорилиране на глицералдехид 3-фосфат

Този процес (фиг. 5-11) е част от гликолизата. Той илюстрира основен принцип в биоенергетиката: окислението на субстрата е съпроводено с отделяне на енергия; отделената енергия се акумулира в макроергично съединение.

  Фиг. 5-11. Молекулен механизъм на окислителното фосфорилиране на глицералдехид-3-фосфат.

Субстрат на реакцията е глицералдехид-3-фосфат. Катализира се от глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа. В активния център на ензима има -SH група от цистеинов остатък за свързване на субстрата. Като коензим участва редокс-системата НАД+. Алдехидната група на субстрата се окислява, отделя се енергия и тя се акумулира в макроергична тиоестерна връзка в рамките на ЕS комплекс. Редокс-системата се редуцира. Външен окислен НАД+ измества редуцирания НАДН.

В следващия етап тиоестерната връзка се превръща в ацилфосфатна. Ензимът, освен оксидоредуктазна, има и трансферазна активност - катализира още една реакция - прехвърляне ацилния радикал върху фосфат. Получава се 1,3-бисфосфоглицерат.

След това макроергичният фосфат от 1,3-бисфосфоглицерат се пренася върху АДФ - образува се АТФ и 3-фосфоглицерат. Тази реакция се катализира от фосфоглицерат киназа.

Сумарната реакция е окисление на глицералдехид-3-фосфат до 1,3-бисфосфоглицерат с редукция на НАД+, спрегнато със синтезата на АТФ от АДФ и Ф. Фосфорната киселина се издига от нулево на високо макроергично ниво в АТФ.

5.3.4 Енолазна реакция

Тази реакция (фиг. 5-12) също е част от гликолизата.

Фиг. 5-12. Окислително фосфорилиране при енолазна реакция.

Енолазната реакция е забележителна с 2 неща:
1) Тя е единствената позната реакция, при която фосфатната група се издига от нормоергично ниво (в 2-фосфоглицерат) до макроергично ниво (във фосфоенолпируват).
2) При тази реакция се получава енол-фосфатната макроергична връзка с най-висока DGo' = - 61.9 kJ/mol (виж табл. 5-1 в т. 5.1.6) без видимо да протича окислителен процес. За разлика от горния пример тук не участва НАД+ или друга редокс-система, а се отделя вода. Отделянето на вода, обаче, може да се разглежда като вътрешномолекулна оксидоредукция - водород се отделя от втория въглероден атом (окисление), а хидроксилна група - от третия въглероден атом (редукция).

Това вътрешно-молекулно прегрупиране е съпроводено с отделяне на енергия, която се акумулира в макроергичната енол-фосфатна връзка. Така че всъщност енолазната реакция, привидно изключение от правилото, също илюстрира общия биоенергетичен принцип, че в резултат на оксидо-редукция се отделя енергия и тя се акумулира в макроергична връзка.

В следващата реакция под действие на пируват киназа енергията, акумулирана в ФЕП, се използва за синтеза на АТФ, като ФЕП се превръща през енол-пируват в неговия тавтомер пируват в кето-форма. В този случай фосфатната група се прeнася на високо макроергично ниво (от ФЕП върху АДФ до получаване на АТФ). Тавтомеризирането на енол-пируват в кето-формата, обаче е силно екзергонична реакция, чиято DGo' осигурява енергия, повече от необходимата за синтеза на АТФ. Това е причината и за необратимостта на пируват киназната реакция.

5.3.5 Значение на гликолитичните фосфорилирания

Макар и количественият принос на субстратните гликолитични фосфорилирания да е скромен, разгледаните реакции имат значение, тъй като:
1) В условията на кислородна недостатъчност, напр. в усилено работещ мускул, те са единственият източник на АТФ
2) Не се повлияват от вещества, които инхибират или разстройват (разпрягат) окислението в дихателните вериги и спрегнатото с него фосфорилиране;
3) при митохондрийни заболявания снабдяват клетката с АТФ;
4) доставят АТФ, когато енергията, отделена в дихателната верига, се използва не за синтеза на АТФ, а за други ендергонични процеси;
5) биосинтезите в цитоплазмата се осъществяват с помощта на гликолитичен АТФ.

5.3.6.-5.3.6.1. Окислително декарбоксилиране на алфа-кето киселини: обща реакция и значение

Окислителното декарбоксилиране на a-кетокиселини (пируват, a-кетоглутарат, a-кетобутират и разклонени кето-киселини) се представя най-общо със следната реакция:

+ KoA-SH
R - CO - COOH ----------------------> R-CO ~ S-KoA + CO2

От карбоксилната група на a-кетокиселината се отделя CO2 с едновременно окисление на a-кето групата до -СООН група, така че от алфа-кето киселината се получава карбонова киселина (под форма на тиоестер с КоА). Най-значими са два случая на окислително декарбоксилиране:
1) пируват до ацетил КоА;
2) a-кетоглутарат до сукцинил -КоА.
Значението на тези реакции е голямо - първата реакция е връзка между гликолизата и цитратния цикъл, а втората е част от цитратния цикъл.

За разлика от гликолитичните фосфорилирания, окислителното декарбоксилиране протича не в цитоплазмата, а във вътрешната митохондрийна мембрана, така че отделеният от субстрата водород лесно постъпва в дихателната верига. И в двата случая се катализира от сложни тройни ензимни комплекси: пируват дехидрогеназен комплекс и a-кетоглутарат дехидрогеназен комплекс, които се отличават само по първия ензим в комплекса. Затова в т. 5.3.6.2. ще се разгледа само комплексът, действащ върху пируват.

Организирането на ензимите в сложно устроени комплекси има следните предимства:
1) Разстоянието, което субстратите трябва да изминат между активните центрове на ензимите е по-малко, отколкото ако ензимите не са в комплекс. Това увеличава реакционната скорост.
2) Намалява се възможността междинните метаболити да реагират с други молекули в странични реакции;
3) Реакциите, катализирани от мултиензимния комплекс, се регулират координирано.

5.3.6.2 Пируват дехидрогеназен комплекс

Пируват дехидрогеназният комплекс се състои от три ензима и пет кофактора (фиг. 5-13):

Фиг. 5-13. Опростена схема за структурата на пируват дехидрогеназен комплекс, катализиращ окислително декарбоксилиране на пируват. Показани са кофакторите, необходими за действието на всеки апоензим.

1) пируват дехидрогеназа (въпреки, че действа като декарбоксилаза)1). Действа съвместно с кофактора тиаминпирофосфат (ТФФ) (фиг. 5-14). Тиаминпирофосфат е производно на витамин В1 (тиамин). Витамин В1 съдържа пиримидинов и тиазолов пръстени, свързани чрез метиленова група. От значение за свързването на субстрата и декарбоксилирането му е тиазоловият пръстен.


Фиг. 5-14. Структура на тиамин (витамин В1) (1) и тиамин пирофосфат (2).

2) дихидролипоил трансацетилаза2). Съдържа като простетична група липоева киселина (ЛК), която е под форма на липоамид, тъй като е ковалентно свързана чрез киселинно-амидна връзка към e-амино-група на лизилов остатък в апоензима. Свободен (неензимно свързан) кофактор КоА-SH (фиг. 5-15) е необходим, за да поеме окисления продукт от Е2. КоА е сложно съединение, производно на витамина пантотенова киселина. Чрез SH-групата на биогенния амин цистеамин КоА образува макроергични тиоестери с карбонови киселини.


Фиг. 5-15. Структура на КоА.
Към аденилов нуклеотид е прикрепена пантотенова киселина, а към нея цистеамин. Пантотеновата киселина съдържа пантоева киселина (a,g-дихидрокси-b, b-диметилмаслена киселина) и b-аланин. SH-групата на цистеамин образува тиоестерна връзка с получаващата се -СООН група.

3) дихидролипоил дехидрогеназа3). Съдържа ФАД като простетична група и се нуждае от НАД+, за да се възстанови ФАД в окислена форма.

Всеки един от тези три ензими се състои от голям брой субединици. Напр. за Е. coli организацията е следната: 24 субединици от Е1 и 12 субединици от Е3 са подредени около сърцевина от 24 субединици от Е2. При еукариоти комплексите са още по-сложни - 60 субединици от Е1 и 12 субединици от Е3 са подредени около 60 субединици от Е2.

5.3.6.3 Молекулен механизъм на окислителното декарбоксилиране на пируват

През първия етап (фиг. 5-16) пируват дехидрогеназата съвместно с ТФФ свързва пируват към тиазоловия пръстен на ТФФ и го декарбоксилира до активен ацеталдехид (1).

Фиг. 5-16. Молекулен механизъм на окислителното декарбоксилиране на пируват под действие на пируват дехидрогеназния комплекс.

1 - свързване на пируват и декарбоксилиране на пируват; 2 - окисление на хидроксиетил-ТПФ; и пренос на ацетиловия радикал  върху окислената форма на липоат, свързан от Е2; 3 - прехвърляне на ацетиловия радикал от липоамид върху КоА; 4 - дехидрогениране на липоевата киселина; 5 - окисление на ФАДН2.

През втория етап активният ацеталдехид се пренася върху липоева киселина (ЛК) в окислена форма, и свързан с нея, се окислява до активен ацетат (2). При това ЛК се редуцира с разтваряне на дисулфидния мост, а отделената при окислението на активния ацеталдехид до активен ацетат енергия се акумулира в тиоестерна макроергична връзка в рамките на ЕS комплекс между Е2 и субстрата. Е2 има и втора активност - да прехвърли получения ацетилен радикал от липоева киселина върху КоА като акцептор (3). Получава се макроергичен продукт ацетил КоА с тиоестерна макроергична връзка, а липоевата киселина остава редуцирана.

В третия етап Е3-ФАД окислява Е2-ЛК(SН)2 (4), а външен НАД+ окислява Е3-ФАД (5). За да се обясни последното, трябва да се има предвид следното: Стандартният редокс-потенциал на свободен ФАД е по-висок от този на НАД+ /НАДН + Н+, но ензимно свързаният ФАД, поради локални взаимодействия на заредени групи в апоензима близо до ФАД, има по-нисък редокс-потенциал и е възможно да редуцира НАД+. Полученият редуциран НАД е субстрат за дихателната верига, която също е локализирана във вътрешната митохондрийна мембрана.

5.3.6.4 Роля на витамините в окислителното декарбоксилиране на алфа-кетокиселини

Четири от петте кофактори в окислителното декарбоксилиране са производни на витамини. Тук участват тиамин (В1) под форма на тиаминпирофосфат, рибофлавин (В2) под форма на ФАД, никотинамид (РР) под форма на НАД и пантотенова киселина под форма на КоА.

Витамин В1 освен в окислително декарбоксилиране е кофактор и на транскетолазата в пентозофосфатния път (пренос на С2 фрагменти). Има го в пълнозърнести житни семена и месо.

Нарушението на окислителното декарбоксилиране при авитаминоза В1 (при консумиране на лющен ориз, захар, бяло брашно или при алкохолици, които почти не приемат храна) води до заболяването бери-бери - в началото се засяга периферната нервна система, характерни са изтощение, мускулна слабост, кожни нарушения, загуба на тегло. По-късно това прогресира до сърдечно-съдова, нервна и мускулна дегенерация.
Описание на бери-бери е направено от Якобус-Бонитус 1630 г., когато е работил на остров Ява: "Бери-бери (= овца) е едно много мъчително заболяване. При поразените от тази болест треперят коленете, те повдигат високо крака и ходят подобно на овце. Това е вид паралич или по-скоро тремор. При болните има отклонения в характера на движението, нарушава се чувствителността на ръцете и краката, а понякога и на цялото тяло." (цитирано по [5]).

5.4.-5.4.1. Дихателни вериги: резюме

Дихателната верига е сложно организирана и специализирана система във вътрешната митоходрийна мембрана със следните функции: да събира редуциращи еквиваленти от различни субстрати, да ги пренася към О2 (окисление) и да акумулира отделената при окислението енергия като синтезира АТФ (окислително фосфорилиране).

Дихателната верига се състои от разтворими и мембранно свързани компоненти, които са организирани в 4 комплекси, действащи съвместно с АТФ синтаза. Някои от компонентите пренасят по 1 електрон (Fe-S-белтъци, цитохроми, Cu-йони). Други пренасят по 2 електрона (КоQ, ФМН, ФАД).

Електроните се придвижват от редокс-центрове с по-нисък (по-отрицателен) редокс-потенциал към редокс-центрове с по-висок (по-положителен) редокс-потенциал. Чрез опити с инхибитори на електронния транспорт е установена последователността на дихателните преносители и мястото на постъпване на електроните в дихателната верига.

Комплекс І (850 kD) се състои от 43 субединици с простетична група редокс-системата ФМН. Част от субединиците са Fe-S белтъци. Те съдържат Fe-S кластери като простетични групи, участващи в електронния транспорт. Комплекс І пренася два електрона от НАДН към КоQ и изпомпва 4 протона в интрамембранното пространство.

Комплекс ІІ се състои от сукцинат дехидрогеназа с простетична група ФАД и още три малки хидрофобни субединици, Fe-S кластери, и цитохром b560. Комплекс ІІ пренася електрони от сукцинат през ФАД към КоQ, но отделената енергия не е достатъчна за синтеза на АТФ.

Комплекс ІІІ в бозайници е димер, като всеки мономер се състои от 11 субединици, в които влизат цитохром b562 (bН), цитохром b566 (bL), цитохром c1 и един Fe-S белтък. Комплекс ІІІ пренася 2 електрона от КоQH2 към 2 молекули цитохром с и посредством Q-цикъла изпомпва 4 протони в интрамембранното пространство.

Комплекс ІV в бозайници е димер. Всеки мономер се състои от 13 субединици, като трите най-големи и най-хидрофобни субединици (І, ІІ и ІІІ) са митохондрийно кодирани. Комплекс ІV има 4 редокс-центра: меден атом, известен като CuB, цитохром a и цитохром a3 (свързани към субединица І) и двойка медни атоми, известни като CuA-център (свързан към субездиница ІІ). Комплекс ІV редуцира О2 до 2 H2О като използва 4 електрона от цитохром с и 4 протона от матрикса. За всеки 2 електрона, които редуцират кислород, се изпомпват в интрамембанното пространство 2 протона.

Съгласно химио-осмотичната теория преносът на електрони по дихателната верига е движеща сила за изпомпване на протони в интрамембранното пространство от комплекси І, ІІІ и ІV, при което се установява трансмембранен електрохимичен градиент. Обратното връщане на протоните в матрикса през Fo-компонент на АТФ-синтазата (F1-Fo-АТФаза) задвижва нейния F1-компонент да синтезира АТФ от АДФ и Ф.

Коефициентът на окислително фосфорилиране Р/О, показващ броя на молекулите синтезиран АТФ за 1 атом О редуциран, не е задължително да бъде цяло число. Теоретично изпомпването на 10 протони при преноса на електрони от НАДН към кислород е достатъчно за синтез на 3 мола АТФ. При пренос на електрони от сукцинат през ФАД се изпомпват 6 протони, което е достатъчно за синтеза на 2 мола АТФ. Преносът на 2 електрона през комплекс ІV изпомпва 2 протона, достатъчно за синтеза на 1 мол АТФ. Експериментално определяните стойности на Р/О не са цели числа, а са 2.5, 2 и 1, съответно за пренос на електрони от комплекс І до О2, комплекс ІІ до О2 и комплекс ІV до О2.

Вещества, които снемат мембранния потенциал, действат като разобщители (напр.отровата 2,4-динитрофенол и естествени разпрягащи агенти като Ca2+, мастни киселини, билирубин и др.). Олигомицин и други вещества, които се свързват към Fo-компонент на АТФ-синтазата действат като инхибитори на окислителното фосфорилиране, тъй като прекратяват обратния пренос на протони от междумембранното пространство към матрикса.

Познанията върхху дихателни вериги обясняват действието на опасни отрови. Ротенон и барбитурати, антимицин А и смъртоносните КСN и CO, съответно действат като инхибитори на електронния транспорт в комплекс І, ІІІ и ІV. Смъртоносна за алкохолици е комбинацията от барбитурати и етанол, тъй като етанолът усилва депресиращия ефект на барбитурати върху централната система

5.4.2 Локализация и функции - общ поглед

При синтеза на АТФ за сметка на енергия, отделена при окисление в дихателната верига, се говори за окислително фосфорилиране или енергетично спрягане в дихателната верига.

Дихателната верига е локализирана във вътрешната митохондрийна мембрана. Тя е сложно организирана и специализирана система (фиг. 5-17-1) със следните функции:
1) Събиране на редуциращи еквиваленти (водородни атоми или електрони) от различни субстрати.
2) Пренос на редуциращи еквиваленти към молекулен кислород (окисление в дихателната верига);
3) Синтеза на АТФ за сметка на енергията, отделена при окислението (окислително фосфорилиране в дихателната верига)

Тези функции се изпълняват от високомолекулни и сложно устроени оксидо-редуктази (с различни редокс-системи), подредени в белтъчно-липидния слой на вътрешната митохондрийна мембрана по нарастващ редокспотенциал и действащи съвместно със също тъй мембранно разположената и сложно устроена АТФ-синтазна система.

Фиг. 5-17-1. Общ поглед върху четирите комплекси на дихателната верига и някои допълнителни ензими, доставящи водород от различни субстрати.
Най-големи количества водород постъпват през комплекс І, дехидрогениращ НАДН. Сукцинат се дехидрогенира от комплекс ІІ. За ацил-КоА, глицерол-3-фосфат и др. има допълнителни специфични флавопротеини, не участващи в четирите комплекси. Тези комплекси, както и непоказаната АТФ синтаза, са разгледани в следващите точки.

Първата функция (събиране на редуциращи еквиваленти) се изпълнява от комплекси І и ІІ, които съдържат флавинови и други редокс-системи. Най-големи количества водород под форма на НАДН постъпват през комплекс І. НАДН е субстрат за действието на този комплекс.

Субстратът НАДН се получава в три вида процеси: 1) множество субстратни дехидрогенирания в матрикса на митохондриите, 2) окислително декарбоксилиране на a-кетокиселини; 3) чрез малатната совалкова система, внасяща цитоплазмен Н в митохондриите (вж глава 6).

Сукцинатът е субстрат на комплекс ІІ.

В дихателната верига има и други флавопротеини, близки по структура и функции на комплекс ІІ. Тук спадат ацил КоА дехидрогеназа, електрон-пренасящ белтък, глицеролфосфат дехидрогеназа и др. Всички те имат висока специфичност по отношение на субстратите-донатори на водород - всеки ензим има свой субстрат. Те са анаеробни дехидрогенази и при физиологични условия предават редуциращите еквиваленти само на КоQ, а не на кислорода. Те са сложно устроени, с четвъртична структура. Като редокс-центрове съдържат ФАД и Fe-S белтъци. Благодарение на тези флавопротеини субстрати с по-висок редокс-потенциал могат да доставят водород за дихателната верига.

Втората функция (окисление) се осъществява от всички компоненти на дихателната верига.

Третата функция се осъществява с участието на комплекси І, ІІІ и ІV, действащи като протонни помпи, и от мембранната АТФ-синтаза.

5.4.3 Молекулно устройство и действие на дихателната верига

Някои от компонентите на дихателната верига са разтворими и подвижни, а други са мембранно свързани. Компонентите са организирани в 4 комплекса, действащи съвместно с АТФ синтаза (фиг. 5-17-2).

Тези комплекси са разположени асиметрично - някои компоненти пронизват мембраната и се издават и към матрикса, и към междумембранното пространство. Едни са по-близо до матрикса, а други до междумембранното пространство.

     Фиг. 5-17-2. Асиметрично разположение на компонентите на дихателната верига във вътрешната митохондрийна мембрана. С римски цифри от І до ІV са означени описаните в текста комплекси в дихателната верига.

Комплекс І (НАДН-КоQ оксидоредуктаза)
Използва се и названието НАДН-дехидрогеназен комплекс или просто НАДН-дехидрогеназа. Този огромен (850 kD) комплекс се състои от 43 субединици, пронизвайки вътрешната митохондрийна мембрана и издавайки се както към интрамембранното пространство, така и към матрикса.

Като простетична група участва редокс-системата ФМН (виж т. 5.2.6.2). Част от субединиците са Fe-S белтъци. Те съдържат различни Fe-S кластери като простетични групи (най-вече [2Fe-2S] и [4Fe-4S]), участващи в електронния транспорт. В тях желязото е нехемово и е свързано координативно със S атоми. Сярата в тези кластери е два вида - неорганична и органична - от цистеинови остатъци на белтъците.

Комплекс І пренася два електрона от НАДН към КоQ в следната последователност:

НАДН --> ФМН --> Fe-S кластери --> КоQ

Комплекс І е анаеробна дехидрогеназа (виж. т.5.2.5.1). Той е входна врата за постъпване на Н в дихателната верига. Осигурява висока ефективност на електронния пренос. При физиологични условия предава редуциращи еквиваленти само на КоQ, но не директно на О2. Строгата му анаеробност in vivo е от решаващо значение за постепенното (на порции) окисление и акумулиране на освободената енергия.

Комплекс І е една от трите протонни помпи в дихателната верига. При пренос на 2 електрона от НАДН към KoQ изпомпва 4 протона в интрамембранното пространство (фиг. 5-18-1). Конформацията на окислената и редуцираната форми са различни. В окислено състояние протоните се свързват към аминокиселинни остатъци от матриксовата страна на мембраната. Редукцията води до конформационни промени, при които протонираните групи са вече към интрамембранното пространство и освобождават там протоните.


Фиг. 5-18-1. Схема за възможното действие на комплекс І като протонна помпа.
Движеща сила за протонната транслокация е електронният пренос между редокс-центровете в комплекс І.

Комплекс ІІ (сукцинат - КоQ оксидоредуктаза)

Този комплекс бе известен и просто като сукцинат дехидрогеназа, но вече се знае, че се състои от сукцинат дехидрогеназа с простетична група ФАД и още три малки хидрофобни субединици, Fe-S кластери, и цитохром b560. Комплекс ІІ пренася електрони от сукцинат през ФАД към КоQ, но отделената енергия не е достатъчна за синтеза на АТФ.

Комплекси І и ІІ не действат последователно, а успоредно. И двата комплекса прехвърлят водород от своите субстрати върху KoQ и го редуцират.

КоQ или убихинон, който е подвижен компонент в дихателната верига, служи като колектор на електрони. Продукт на комплекси І и ІІ, той е субстрат за действието на комплекс ІІІ. В окислената и редуцираната си форма КоQ функционира като свободна, нискомолекулна, несвързана с белтък редокс-система. Вече знаем неговата структура (фиг. 5-7 в т. 5.2.6.3). Бензохиноновото ядро и изопреновата верига му придават липофилни (хидрофобни) свойства, които го правят много удобен за изпълнение на биологичната роля - пренос на редуциращи еквиваленти от неподвижно вградените в мембраната ФП към също така неподвижно вградените цитохроми. Наличието и на трета семихинонова форма позволява той да осъществява преход от дву- към едноелектронен пренос. Тази форма има важно значение и за протичане на т.н. Q-цикъл, който е част от дейността на комплекс ІІІ.

Комплекс ІІІ (Коензим Q - цитохром c оксидоредуктаза)

Известен е като b-c1-комплекс или цитохром c редуктаза. Комплекс ІІІ в бозайници е димер, като всеки мономер се състои от 11 субединици, в които влизат цитохром b562, цитохром b566, цитохром c1 и един Fe-S белтък. Комплекс ІІІ пренася 2 електрона от КоQH2 към 2 молекули цитохром с и посредством Q-цикъла (фиг. 5-18-2) изпомпва 4 протони в интрамембранното пространство съгласно следното уравнение [1]:

КоQH2 + 2 cytochrome c1(Fe3+) + 2H+ (от матрикса) ----->
-----> KoQ + 2 cytochrome c1(Fe2+) + 4H+ (отвън)
QH. е прикрепен от двете страни на мембраната към специален Q-свързващ белтък. QH2 и Q са подвижни.

Цитохромите в комплекса се подреждат по нарастващ редокс-потенциал, както следва: b566, b562, c1. Като простетична група всеки цитохром съдържа хем (желязо-порфиринов пръстен). В редуцирана форма валентността на желязото е +2, в окислена +3.


Фиг. 5-18-2.Схема за възможното действие на комплекс ІІІ като протонна помпа посредством Q-цикъла. QH. е прикрепен от двете страни на мембраната към специален Q-свързващ белтък. QH2 и Q са подвижни. Цитохроми b562 и цитохром b566 са представени в зелен цвят.

Цитохром с (фиг. 5-18-3) е нискомолекулен периферен мембранен белтък (13 kD). Съдържа една полипептидна верига с 19 лизинови и 3 аргинилови остатъка, поради което е алкален белтък с рI 10.6. Чрез положително заредените лизилови и аргинилови групи се свързва със своите биологични партньори комплекс ІІІ (цитохром с редуктаза и комплекс ІV (цитохром с оксидаза), а също и с фосфолипидите от мембраната чрез електростатични взаимодействия. Тези сравнително по-слаби връзки позволяват той да се изолира лесно от мембраната, за разлика от другите цитохроми. Приема се, че е белтъчен преносител на електрони, без ензимни функции. С ниската си молекулна маса, форма и структура той е идеално пригоден да поема електрони от цитохром с редуктазата и да ги предава на цитохром с оксидазата. Той е от най-детайлно изучените белтъци. Знае се първичната структура на цитохром с от над 120 вида - от най-низши организми до човек. Оказва се, че няколко лизинови остатъци са строго консервативни в течение на еволюцията, следователно са жизнено важни (Лиз13, Лиз 72, Лиз 86, Лиз87, а също и Лиз8, Лиз25, Лиз 27, Лиз 73, Лиз79. Именно те образуват пръстен около хема и участват във взаимодействието с кисели групи от комплекс ІІІ и комплекс ІV. Модифицирането им (блокирането им) с различни вещества намалява в различна степен електрон-пренасящата способност на цитохром с и така се съди за важността на всеки лизинов остатък.

Фиг. 5-18-3.Структура на цитохром с.
Фигурата е приготвена с програмата Raswin [7], ползвайки данните за атомните координати на цитохром с cот Protein Data Bank [10].

a-Спиралните участъци в полипептидната верига са представени с модел тип "панделка" в синьо, хемът с модел "топки и пръчки" в червено, а консервативните лизинови остатъци, заобикалящи хема и имащи значения за взаимодействие с кисели групи от комплекс ІІІ (b-c1) и комплекс ІV (цитохром c оксидаза) са представени с модел тип "пръчки" в жълто и са означени техните номера. Особено важни за елeктронния пренос са Лиз 13, Лиз 86, Лиз 87 и Лиз 72.

Комплекс ІV в бозайници е димер. Всеки мономер се състои от 13 субединици, като трите най-големи и най-хидрофобни субединици (І, ІІ и ІІІ) са митохондрийно кодирани. Комплекс ІV има 4 редокс-центра: меден атом, известен като CuB, цитохром a и цитохром a3 (свързани към субединица І) и двойка медни атоми, известни като CuA-център (свързан към субединица ІІ). Комплекс ІV редуцира О2 до 2 H2О като използва 4 електрона от цитохром с и 4 протона от матрикса. За всеки 2 електрона, които редуцират кислород, се изпомпват в интрамембанното пространство 2 протона.

В обобщение:

Някои от компонентите на дихателната верига пренасят по 1 електрон (Fe-S-белтъци, цитохроми, Cu-йони). Други пренасят по 2 електрона (КоQ, ФМН, ФАД).

Електроните се придвижват от редокс-центрове с по-нисък (по-отрицателен) редокс-потенциал към редокс-центрове с по-висок (по-положителен) редокс-потенциал.

Компонентите на дихателната верига са в динамично състояние. Те периодично минават от окислено в редуцирано състояние, и обратно, както личи от фиг. 5-19.

Комплекс І, комплекс ІІІ и комплекс ІV действат като протонни помпи.

Фиг. 5-19. Динамично преминаване на компонентите на дихателната верига от редуцирана в окислена форма и обратно. Показана е опростено само началната част на веригата - последователна оксидоредукция между НАДН, ФМН от комплекс І и КоQ.

5.4.4 Термодинамика на електронния транспорт в местата за протонна транслокация

При окисление на НАДН от O2 в дихателната верига общата промяна в стандартната свободна енергия DGo' е - 218 kJ/mol съгласно ур. 5.2.4 (табл. 5-5). Тъй като за синтеза на 1 мол АТФ се изискват 30.5 kJ/mol, то теоретично отделената при окислението на НАДН енергия е достатъчна за синтеза на няколко мола АТФ. Тази енергия се отделя не наведнъж, а на порции, като в някои от етапите енергията не достига за синтеза на АТФ и се разсейва като топлина.

Ако разликата в редокспотенциала между съседни редокс-центрове е около или по-голяма от 0.19-0.20 V, то отделената енергия съгласно ур. 5.2.4 ще бъде повече от 30.5 KJ/mol, т.е. достатъчно за синтеза на 1 мол АТФ. В табл. 5-5 са дадени изчислените според ур. 5.2.4 стойности на DGo' за реакциите, катализирани от комплексите на дихателната верига.

Табл. 5-5. Стойности на отделената енергия в реакциите, катализирани от комплексите на дихателната верига.

Комплекс Реакция DEo' (V) DGo' (kJ/mol)
І НАДН + Н+ + КоQ --> НАД+ + КоQH2 0.360 - 69.5
ІI ФАДН2 + КоQ --> ФАД + КоQH2 0.085 - 16.4
ІII КоQH2 + цит. c (Fe3) --> КоQ + цит. c (Fe2) 0.190 - 36.7
ІV цит. c (Fe2) + 1/2 O2 --> цит. c (Fe3) + H2O 0.580 - 112
Общо четирите комплекса НАДН + Н+ + 1/2 O2 --> НАД+ + H2O 1.130 - 218

Вижда се, че в комплекси І, ІІІ и ІV отделената енергия е достатъчно за синтеза на АТФ. Затова дълго време се смяташе, че именно в тези три места (първо, второ и трето) става спрягане на окислението с фосфорилиране на АДФ до АТФ. Наричаха се и все още в някои учебници се наричат енергетично спрягащи или фосфорилиращи места. След възприемане на химиосмотичната теория (т. 5.4.9) те се означават като места за протонна транслокация.

Трябва да се подчертае, че комплекс І (първо място), комплекс ІІІ (второ място) и комплекс ІV (трето място) не синтезират директно АТФ, както първоначално бе смятано. Както бе показано в т. 5.4.3 те действат като протонни помпи - пренасят електрони към кислорода и изпомпват протони от матрикса в интрамембранното пространство, при което възниква трансмембранен протонен градиент. Неговата енергия се използва за синтеза на АТФ от АТФ синтазата.

5.4.5 Коефициент на окислителното фосфорилиране

Коефициентът на окислителното фосфорилиране ( Р/О) е отношение, което показва колко мола АТФ се синтезират от АДФ и Ф при транспорт на два електрона към един атом кислород до получаване на вода в дихателната верига.

Измерването на този коефициент в изолирани митохондрии при различни експериментални условия е било полезно както за установяване подреждането на компонентите на дихателната верига, така и за осветляване механизма на окислителното фосфорилиране.
Той има различна стойност в зависимост от субстрата, доставящ водород за дихателната верига (вж табл. 5-6).

Табл. 5-6. Стойности на коефициента на окислително фосфорилиране Р/О при окисление на различни субстрати.


Субстрат
Работещи места за
протонна транслокация
Теоретични стойности за Р/О

Ревизирани стойности** за Р/О
НАДН
първо, второ, трето
3
2.5
сукцинат
второ, трето
2
1.5
аскорбат + ТМФД*
трето
1
1

*ТМФД - тетраметил-р-фенилен диамин - липидно разтворимо вещество, което заедно с аскорбат подава електрони на комплекс ІV.
** по P. Hinkle [6].

Преносът на 2 електрона през комплекси І, ІІІ и ІV е свързано с изнасяне на 10 протони от матрикса в интрамембранното пространство. Отделената при това енергия е достатъчна за синтеза на три мола АТФ (Р/О = 3). Субстратите с по-висок редокс-потенциал подават водород в по-късен етап и някои от местата за протонна транслокация не работят. Напр. електроните от ФАДН2 не минават през комплекс І и поради това се изнасят само 6 протони, което е достатъчно за синтеза на 2 мола АТФ (Р/О = 2). Преносът на 2 електрона само през комплекс ІV е свързано с изнасяне на 2 протона и това е достатъчно за синтеза на 1 мол АТФ (Р/О = 1).

Експерименталните стойности за Р/О не са били цели числа, но дълго време бяха закръглени на цели числа, т.е. ползваха се теоретичните стойности, дадени в табл. 5-6. Трябва да се има предвид, че част от протонния градиент се използва и за други ендергонични процеси, а също, че макар и в слаба степен може да има неспецифично снижаване на протонния градиент. През 1991 г. P. Hinkle преразгледа стойностите за P/O и показа, че вместо 3, 2 и 1, те трябва да се корегират на 2.5, 1.5 и 1. Тези ревизирани стойности са в съгласие с химиоосмотичната теория за механизма на окислителното фосфорилиране, разгледана в т. 5.4.9.

5.4.6 Инхибитори на електронния транспорт.

За определяне точното подреждане на компонентите на дихателната верига допринесоха и опитите с инхибитори на електронния транспорт. Тези опити осветлиха и механизма на действие на някои отрови. Инхибиторите на електронния транспорт са вещества, които спират преноса на електрони в енергетично спрягащите места на дихателната верига (вж фиг. 5-20) и вторично спират и фосфорилирането.

Фиг. 5-20. Енергетично спрягащи (фосфорилиращи места, места за протонна транслокация) в дихателната верига и специфични за тях инхибитори на електронния транспорт.

Специфични за първо място са напр. ротенон, барбитурати и др.; за второ място - напр. антимицин А; за трето място - СО, КСN и др. Инхибиторите разделят дихателната верига на окислен и редуциран сегмент. В мястото на блока два съседни дихателни преносители са в противоположно редокс-състояние: преди блока преносителят е в максимално редуцирано състояние, а след блока - в максимално окислено състояние.

На фиг. 5-21 е показан полярографски запис на кислородна консумация на изолирани митохондрии.
Скалата на полярографския апарат се наглася така, че да е между 0 до 100 % кислород. Първоначално в съдчето на полярографа се поставят митохондрии в изотоничен буфер. Поради липса на субстрат окисление не се извършва - няма консумация на кислород и писецът върви хоризонтално. Добавя се НАДН. Започва окисление. Скоростта му се изчислява от наклона на правата. Добавя се ротенон, окислението се инхибира и писецът върви хоризонтално. Възобновяването на окислението при добавяне на сукцинат означава, че той доставя Н за дихателната верига в по-късен етап след първото фосфорилиращо място. Антимицин А инхибира сукцинатното окисление, но то може да се възобнови от аскорбат в комбинация с ТМФД. Следователно те доставят електрони за веригата в етап след второто фосфорилиращо място. Аскорбатното окисление се инхибира от КCN. Стойността на Р/О в присъствие на инхибитори на електронния транспорт е нула. Щом няма окисление, няма отделяне на енергия и АТФ не се синтезира - виж табл. 5-7.

Фиг. 5-21. Електронен транспорт в изолирани митохондрии при добавяне на различни субстрати и инхибитори, проследен чрез измерване на кислородната консумация.

Субстрат

Работещи места за протонна транслокация

Теоретични стойности за Р/О

НАДН

първо, второ и трето

3

НАДН + ротенон

-

0

сукцинат + ротенон

второ и трето

2

сукцинат + антимицин А

-

0

сукцинат + KCN

-

0

аскорбат + ТМФД* + антимицин А

трето

1

сукцинат +2,4-ДНФ**

-

0

сукцинат + олигомицин**

-

0

*ТМФД - тетраметил-р-фенилен диамин - липидно разтворимо вещество, което заедно с аскорбат подава електрони на комплекс ІV.
**Действието на 2,4-ДНФ ( разпрягащ агент) и на олигомицин (инхибитор на окислителното фосфорилиране) е разгледано в т. 5.4.8.

5.4.7 Дихателен контрол

Дихателният контрол представлява обратимо повлияване на електронния транспорт (окислението) в дихателната верига от съотношението в концентрациите на АДФ и АТФ. Това е възможно, тъй като окислението и фосфорилирането са спрегнати, взаимозависими процеси, които нормално не могат да функционират един без друг. При извършване на работа се разгражда АТФ до АДФ и това стимулира окислението. То, от своя страна, отделя енергия за синтеза на АТФ.

Измерването на кислородната консумация в присъствие и отсъствие на АДФ позволява да се измерва и степента на дихателен контрол. На фиг. 5-22 е представен полярографски запис, демонстриращ дихателен контрол, упражняван от АДФ. Добавеният АДФ (акцептор на енергията) стимулира окислението, докато се превърне в АТФ. Тогава без друга добавка дишането възстановява началния слаб интензитет. Нова добавка на АДФ отново би стимулирала окислението и това може да се наблюдава докато свърши кислородът в полярографската клетка. Състоянието на митохондриите след добавяне на АДФ се нарича активно, а след изчерпването на АДФ - контролируемо или неактивно състояние. По-късно е било установено, че всъщност не само АДФ, а фактически отношението [АДФ] [Ф] / [АТФ], наричано фосфатен потенциал, упражнява дихателния контрол. Високи стойности на АДФ и Ф стимулират окислението, а високи стойности на АТФ го инхибират.

Фиг. 5-22. Полярографски запис на кислородна консумация, демонстриращ дихателен контрол в изолирани митохондрии. Означения: с. 4 - неактивно (контролируемо) състояние; с. 3 - активно състояние след добавяне на АДФ. Тези означения са въведени от B. Chance (USA), който е описал пет възможни състояния за митохондриите в зависимост от наличието или отсъствието на субстрати, кислород, АДФ и активността на ензимите.

Дихателен контрол се демонстрира само в добре спрегнати митохондрии - т.е. в митохондрии, в които процесите на окисление и фосфорилиране са взаимозависими. Затова наличието на дихателен контрол е чувствителен тест за качеството на изолираните митохондрии - интактност на мембраната и спрегнатост на окислението и фосфорилирането.

5.4.8 Разпрягащи агенти и инхибитори на окислителното фосфорилиране

Опитите с разпрягащи агенти и инхибитори на окислителното фосфорилиране са допринесли за разкриване механизма на образуването на АТФ. Типичен представител на разпрягащите агенти е 2,4-динитрофенол (2,4-ДНФ). Добавени към изолирани митохондрии, тези агенти разединяват (разпрягат) окислението от фосфорилирането (фиг. 5-22 в т. 5.4.7 - за удобство е дадена и тук). Тъй като не се образува АТФ, клетката изпитва недостиг от енергия и компенсаторно пуска в разграждане нови и нови субстрати на окислението. Окислението се усилва неколкократно, но отделената енергия се разсейва като топлина - дихателната верига върви на празен ход. При по-високи дози може да се стигне до смъртен изход.

Фиг. 5-22. Полярографски запис на кислородна консумация, демонстриращ дихателен контрол в изолирани митохондрии. Означения: с. 4 - неактивно (контролируемо) състояние; с. 3 - активно състояние след добавяне на АДФ. Тези означения са въведени от B. Chance (USA), който е описал пет възможни състояния за митохондриите в зависимост от наличието или отсъствието на субстрати, кислород, АДФ и активността на ензимите.

2,4-ДНФ е външно за клетките вещество. В организма обаче има естествени разпрягащи агенти - мастни киселини, Са йони, тироксин, билирубин и др. Това показва, че и разпрегнатото (свободно) окисление има своето значение (виж т. 5.6.).

Типичен представител на инхибиторите на окислителното фосфорилиране е олигомицин. Този антибиотик инхибира АТФ синтазата, свързвайки се с един от нейните участъци. Спирането на фосфорилирането вторично инхибира и окислението. Добавянето на олигомицин инхибира стимулирането на дишането от АДФ (фиг. 5-22 в т. 5.4.7, за удобство представена и тук). Добавянето на разпрягащ агент след олигомицин стимулира окислението. Това показва, че олигомицинът не действа директно върху окислението, а върху етап от фосфорилирането (първичен ефект), а спирането на окислението е вторичен ефект. За разлика от олигомицин, инхибиторите на електронния транспорт първично инхибират окислението, а вторично и фосфорилирането.

5.4.9 Механизъм на окислителното фосфорилиране в дихателната верига

Според по-ранната химическа хипотеза по аналогия със субстратните фосфорилирания във всяко енергетично-спрягащо място отделената енергия се поема от неизвестни междинни спрягащи фактори, при което възникват макроергични съединения, водещи до синтеза на АТФ. Въпреки упоритата работа на водещи изследователски екипи, спрягащите фактори не бяха идентифицирани. Peter Mitchell
 пръв посочи, че те просто не съществуват. Освен това Mitchell е забелязал, че окислително фосфорилиране се извършва само ако мембраната на митохондриите е интактна, неувредена.
Въз основа на тези два факта, на измерванията на рН в митохондрии чрез конструирания от самия него чувствителен рН-метър и на изследванията с разобщители и инхибитори на окислителното фосфорилиране,Mitchell разработи принципно нова схема за механизма на окислителното фосфорилиране. Той постулира и впоследствие бе доказано наличието на:
1) непроницаема за H+ и -ОН - спрягаща митохондрийна мембрана;
2) трансмембранно ориентирани дихателни преносители, осъществяващи векторен пренос на електрони и протони през мембраната;
3) обратима пренасяща протони АТФазна система.

Преносът на електрони по дихателната верига към О2 е движеща сила за изнасяне на протони от матрикса към междумембранното пространство (фиг. 5-23). Това води до възникване на трансмембранен електрохимичен потенциал, който има две компоненти - химична (натрупване на Н+отвън и ОН- вътре в матрикса) и електрична (натрупване на положителни заряди отвън и отрицателни заряди вътре). Експериментално е доказано, че рН в междумембранното пространство е по-ниско, отколкото в матрикса. Този електрохимичен потенциал задвижва синтезата на АТФ под действие на АТФ синтаза. Структурата на този ензимен комплекс е разгледана в т. 5.4.10

Фиг. 5-23. Механизъм на окислителното фосфорилиране според химио-осмотичната теория на Mitchell
.

Днес е общоприето, че комплексите I, III и IV действат като протонни помпи.
Протоните от матрикса излизат навън, при което възниква трансмембранен електрохимичен потенциал. Тъй като мембраната е непропусклива за протони, връщането им в матрикса става по градиента, но само през молекулния комплекс на АТФ-синтазата. Преходът на протони от зона с висока концентрация на протони към зона с ниска концентрация води до отделяне на свободна енергия, за сметка на която се синтезира АТФ. Така между матрикса и междумембранното пространство се извършва непрекъснат кръговрат на протони, движеща сила на който е транспортът на електрони.

Химиоосмотичната теория обяснява необходимостта от мембрана, създаването на протонен градиент и действието на разпрягащите агенти и олигомицин, както и необходимостта от специални транспортни системи за АТФ, АДФ, Ф, Ca2+, пируват и совалкови системи за внасяне на цитозолен водород. Разпрягащите агенти като слаби ароматни киселини свързват протоните, внасят ги вътре и снемат трансмембранния потенциал. Олигомицинът, токсичен антибиотик, е мощен инхибитор на фосфорилирането, защото се свързва с митохондрийната АТФ синтаза и блокира обратния пренос на протони към матрикса.

5.4.10. Структура и действие на АТФ синтаза

АТФ синтазата е вградена във вътрешната митохондрийна мембрана. Състои се от два главни компонента Fo и F1. Комбинираните данни от кристалографски и биохимични изследвания на F1 от говежди митохондрии и Fо от дрожди са използвани за представяне на общата структура на фиг. 5-24-1 [3, 11, 12, 13]. Компонентът F1 напомня кръгла топка за брава или шапка на гъбка, откъдето е дошло и названието гъбовидни образувания по кристите. Гъбовидните образувания, състоящи се от АТФ синтазни комплекси, са обърнати към матрикса. Гъбките посредством крачета се съединяват с компонента Fо. Индексът "о" не означава нула, а буквата "о", от олигомицин, който се свързва с тази част от молекулата на АТФ синтазата.

Фиг. 5-24-1. Схема за структурата на АТФ синтазен комплекс, получена при комбиниране на данни за компонента F1 от говежди митохондрии и компонента Fo от дрожди съгласно [3, 11, 12, 13]. Обясненията са в текста.

Ако кристите се озвучат с ултразвук, получават се субмитохондрийни частици, в които АТФ синтазните комплекси в гъбките са обърнати към външната среда - "обърнати частици", защото в митохондриите те са насочени навътре към матрикса. Изолирани от мембраната, тези ензимни комплекси катализират разграждането на АТФ. Оттук идва другото име на комплекса: АТФаза. В интактни митохондрии, главната биологическа функция на този ензимен комплекс се състои в синтеза на АТФ, а не в разграждането.

Изследванията на Walker показаха, че F1 от говежди митохондрии се състои от 9 субединици от 5 различни типа α, β, γ, δ, ε в съотношение α3β3γδε. Субединиците α и β оформят главичката подобно дяловете на портокал. Субединиците, изграждащи крачето на компонента F1 са разположени асиметрично. Един от двата домени на γ-субединицата е ориентирана в средата на компонента F1 като централна ос (колона), а другият домен се свързва с една от трите β субединици, означавана като празна. Първоначално се смяташе, че крачето се формира от γ, δ и ε -субединиците, но по-късно бе показано, че това е вярно само за γ и ε  -субединиците, а δ-субединицата е важна за прикрепване на компонента F1 към мембраната. Въпреки, че трите β-субединици имат идентична първична структура, те има различна конформация и една от причините за това е, че в даден момент γ-субединицата е свързана само с една от β-субединиците.

Компонентът Fo се състои от три вида субединици: a, b и с в съотношение: a1 b2 c10-12. Всяка c-субединица се състои от два α-спирални участъцир, огънати във фуркетна форма и съдържащи отрицателно зареден аспартатен остатък на 61 място, участващ в преноса на протони. Мутации, водещи до заместване на този аспартат с друга аминокиселина блокира преноса на протони. Подобни изследвания показаха, че a-субединицата в компонента Fo участва в преноса на протони, а b-субединицата прикрепва Fo към F1. В компонента Fo от говежди митохондрии са установени хомоложни субединици на описаните a, b, c субединици от дрожди, но вероятно там има и други допълнителни субединици.

На фиг. 5-24-2 е даден механизъм за синтезата на АТФ, предложен от P. Boyer [7] въз основа на кинетични и свързващи експерименти. От изследвания с изотопно белязани АТФ, АДФ и Ф бе известно, че синтезата на АТФ, здраво свързан към компонента F1, не изисква енергия. Движението на протоните през АТФ синтазата е необходимо за освобождаване на АТФ от F1.

Фиг. 5-24-2. Механизъм за синтеза на АТФ по [7].  АТФ се синтезира в следните етапи:
1) АДФ и Ф свързват към L-мястото.
2) Енергията на протонния градиент променя природата на свързващите места: L-място се превръща в Т-място; Т-място се превръща в О-място; О-място се превръща в L-място.
3) АТФ, синтезиран в предишния цикъл, се отделя от О-място. АДФ и Ф в Т-място се превръщат в АТФ, който остава здраво свързан до освобождаването му в следващия цикъл.

Бе предположено, че посочените по-горе разлики в конформацията на β-субединиците определят три свързващи места за АТФ/АДФ с различен афинитет. Използването на структурния аналог на АТФ (β,γ-имидоаденозин 5’-трифосфат – виж фиг. 5-24-3 ), който не може да бъде хидролизиран от F1 компонента на АТФ синтазата, доказа че в β-субединиците на всеки от трите αβ-димери на F1-компонента има нуклеотид-свързващо място с различен афинитет към адениловите нуклеотиди:
О-място - с много нисък (нулев) афинитет към лигандите и каталитично неактивно или празно място;
L-място с нисък афинитет към лигандите и каталитично неактивно;
Т-място - здраво свързващо АТФ и каталитично активно.

Boyer предполага, че синтезата включва следните три фази:
1. Поемане на протони от Fo от междумембранното пространство и пренос към F1;
2. Синтеза на АТФ под действие на F1;
3. Използване на енергията на протонния градиент за освобождаване на АТФ от F1, което изисква взаимодействие между Fo и F1.

Конформацианните промени в β-субединиците се предизвикват от преминаването на протони през Fo-компонент. Насоченото движение на потока от протони през Fo-пората завърта цилиндъра от c субединици и прикрепената към него γ-субединица около дългата ос на γ-субединицата. γ-Субединицата минава през центъра на α3β3-главата, която се задържа неподвижно към мембраната благодарение на b2 и δ- субединиците. С всяко завъртане на 120oC γ-субединицата влиза в контакт с различна β-субединица. Този контакт определя конформацията с О-място (празно място). Трите β-субединици взаимодействат по такъв начин, че когато едната е с О-място, съседната β-субединица от едната страна е с конформация с L-място, а съседната от другата страна – с конформация с Т-място. Така всяко пълно завъртане на γ-субединицата предизвиква всяка β-субединица да премине през трите възможни конформации и да се синтезират и освободят от ензима три молекули АТФ.

Фиг. 5-24-3. Структура на β,γ-имидоаденозин 5’-трифосфат – структурен аналог на АТФ, който не може да бъде хидролизиран от от F1 компонента на АТФ синтазата.

Скорошни експерименти [11, 12, 13] потвърдиха модела на Boyer [7]. Завъртането на γ-субединицата заедно с цилиндъра от c субединици спрямо имобилизирани α3β3 -субединици в изолиран F1 компонент бе наблюдавано под микроскоп чрез прикрепване на дълъг флуоресциращ актинов полимер към γ-субединицата (фиг. 5-24-4). Чрез генно инженерство F1 е променен, така че да съдържа последователност от хистидинови остатъци, чрез които да се свърже здраво към микроскопско стъкло. Към една от c субединиците е прикрепен ковалентно биотин. Белтъкът авидин, известен с това, че много здраво свързва биотин, предварително се прикрепя ковалентно към дълги флуоресцентно белязани актинови фибрили. При добавяне на този актин-авидинов комплекс авидин се свързва здраво към биотина, ковалентно прикрепен към c субединицата. При добавяне на субстрата АТФ, белязаните фибрили се въртят последователно в една посока, доказвайки, че цилиндърът от c субединици заедно с γ субединицата се въртят като ротор спрямо статора F1.

Фиг. 5-24-4. Експериментално потвърждение на модела на Boyer чрез имобилизиране на компонента F1 и прикрепване на дълъг флуоресциращ актинов полимер към γ-субединицата.  Хис - последователност от n хистидинови остатъци.

5.4.11 Приложение на познанията върху дихателната верига за изясняване механизма на действие на опасни отрови

Вдишването на HCN или поглъщането на KCN, инхибитори за трето енергетично-спрягащо място, инхибира бързо и смъртоносно цитохром с оксидазната реакция в митохондрийните дихателни вериги. Цианидът е една от най-мощните и бързо действащи отрови. Той се свързва с Fe3+ на хема на цит. аа3 и блокира преноса на електрони към О2. Окислението и фосфорилирането спират и смъртта настъпва за секунди до минути поради недостиг на кислород, най-вече в централната нервна система. Ако диагнозата се постави много бързо, на отровения се дават нитрити, които превръщат окси-хемоглобин в метхемоглобин MetHbOH(Fe3+), а той отнема цианидния йон от цит. аа3-(Fe3+-CN-), образувайки MetHbOH(Fe3+)-CN.
Вкарването на тиосулфат води до превръщане на цианида в безвредния тиоцианат под действие на ензима роданаза.

Барбитуратите, специфични инхибитори за първо енергетично-спрягащо място, се използват като приспивателни. Вземането на по-висока доза може да е смъртоносно. Особено опасна е комбинацията от барбитурати и алкохол [6]. Алкохолът усилва депресиращия им ефект върху централната нервна система и инхибира тяхното разграждане. Трезвият алкохолик е по-нечувствителен към тях, тъй като ги разгражда по-бързо. Обикновено до фатален край се стига, когато трезвият алкохолик не може да заспи, въпреки че е поел барбитурати. Раздразнен, той взема още от тях, а също и алкохол. Заспива, но повече не се събужда поради синергийния ефект на барбитуратите и алкохола.

5.5.-5.5.1. Свободно окисление: резюме

С термина "свободно или неспрегнато окисление" се означава окислението, при което отделената енергия не се акумулира в макроергични съединения.

Свободното окисление има значение:
1) за топлопродукцията в топлокръвните организми. Митохондрийните дихателни вериги в мускули и мастна тъкан се разпрягат от повишено съдържание на висши мастни киселини, отделени от триацилглицероли под въздействие на адреналин, който активира липаза в мастна тъкан. В кафява мастна тъкан има разпрягащ белтък термогенин, през който изпомпаните в интрамембранното пространство протони се връщат в матрикса, шунтирайки АТФ-синтазата. Чрез термогенин, вместо за синтеза на АТФ, енергията на протонния градиент се превръща в топлина.

2) за метаболизма (десатурация на висши мастни киселини, неспецифично хидроксилиране на различни чужди за клетката вещества с цел обезвреждане и за специфично хидроксилиране като част от синтезата на стероидни хормони и други вещества.

Непълната редукция на О2 с единичен електрон под действие на различни фактори води до последователно образуване на супероксиден анион, Н2О2 и хидроксилен свободен радикал, които са токсични - модифицират белтъци, нуклеинови киселини и мембранни липиди. Това може да допринася за стареенето и някои дегенеративни болести. За обезвреждането на тези активни производни на кислорода, в организма има специални ензими - супероксид дисмутаза, глутатион пероксидаза с кофактор глутатион, каталаза. Редуцираната форма на глутатион се поддържа с НАДФН и други редуктори (антиоксиданти) като витамин С, b-каротен и др.

5.5.2 Топлопродукция

Наред със спрегнатото окисление в клетките се извършва и свободно (неспрегнато) окисление. При него отделената енергия не се акумулира в макроергични съединения, а се превръща в топлина, което е важно за поддържане на постоянна телесна температура в топлокръвните организми. Освен за топлопродукция свободното окисление има значение и за метаболизма (виж т. 5.5.3).

При изстудяване на експериментални животни (гълъби), се забелязва, че те поглъщат 2 - 4 пъти повече кислород. Това голямо увеличение на дишането се осъществява чрез включване на основния дихателен апарат на клетките, т.е. митохондрийните дихателни вериги и преминаването им в разпрегнато състояние. Митохондриите на мускулна и кафява мастна тъкан много бързо се разпрягат при изстудяване. При излизане от топла стая на студено, в първите минути неволно потреперваме. Мускулните влакна се съкращават, като използват наличния АТФ. Това трае минути и е достатъчно за пренастройване на дихателните вериги от спрегнато в разпрегнато състояние. Под влияние на студа от студовите рецептори по кожата се изпраща сигнал в централната нервна система, откъдето пък се сигнализира за отделяне на хормона адреналин, който активира липазата в мастна тъкан. Липазата разгражда мастите до висши мастни киселини (ВМК) и глицерол. ВМК действат разпрягащо върху митохондрийните дихателни вериги в мускулите.

В повечето бозайници, вкл. и човека, при новородени има особена кафява мастна тъкан, чиято главна задача е да продуцира топлина за бебето. Тя е разположена отзад на врата на бебетата. Кафявият цвят идва от присъствието на голям брой митохондрии, и следователно голямо количество цитохроми, чиито хемни групи силно поглъщат видима светлина. В кафявата мастна тъкан митохондриите са практически винаги разпрегнати поради високите концентрации на висши мастни киселини. Ако към изолирани митохондрии от кафява мастна тъкан се добави албумин, който свързва мастните киселини, не се проявява разпрягащият им ефект и митохондриите стават спрегнати. Спящите зимен сън животни (кафяви мечки, мечки-гризли) също имат големи количества от тази тъкан.

Митохондриите на кафява мастна тъкан окисляват субстратите, и най-вече мастни киселини, нормално. Електроните по дихателната верига достигат до кислорода, а това е съпроводено с изпомпване на протони от матрикса, както при другите митохондрии. Но митохондриите на кафява мастна тъкан имат уникален белтък термогенин, наричан още разпрягащ белтък. Този вграден във вътрешната мембрана белтък осигурява път за протоните, без да минават през АТФ синтазата (фиг. 5-25). Като резултат от това шунтиране, енергията на окислението не се акумулира в АТФ, а се разсейва като топлина, което допринася за поддържане на телесната температура. А това е много важно за новородените бебета, които нямат козина както при животните.

Фиг. 5-25. Действие на разпрягащия белтък термогенин в митохондрии на кафява мастна тъкан.
Дихателната верига изпомпва протони от матрикса в междумембранното пространство. Вместо през АТФ-синтетазния комплекс, протоните се връщат обратно в матрикса през термогенин, който осигурява алтернативен път. Така вместо за синтеза на АТФ, енергията на протонния градиент се разсейва като топлина, т.е. използва се за топлопродукция

5.5.3 Електронен пренос в ендоплазмения ретикулум

Свободното окисление има и метаболитно значение. В ендоплазмения ретикулум има скъсени електронопреносителни вериги, които се отличават от досега разгледаните дихателни вериги в митохондриите по следните 3 неща:
1) локализация;
2) различни компоненти - вместо НАД, по-често НАДФН е донатор на Н, вместо известните цитохроми участват други цитохроми - напр. цит. Р450, цит. в5;
3) функция - в тях не се произвежда АТФ и топлопродукцията не е главната им задача, макар че известни количества топлина се отделят. В част от веригите се извършва десатурация или получаване на ненаситени мастни киселини (фиг. 5-26), а в други - хидроксилиране на субстрати (фиг. 5-27).


Фиг. 5-26. Скъсена електроно-преносителна верига за десатурация на висши мастни киселини, под форма на активни ацил-КоА. Водородните атоми от мастната киселина редуцират единия кислороден атом. Водородните атоми от НАДФН + Н+ редуцират другия кислороден атом.
Фиг. 5-27. Скъсена електроно-преносителна верига за хидроксилиране на субстрати. Единият кислороден атом се използва за получаване на -ОН група, а другият не остава свободен, а се редуцира от водорода на НАДФН + Н+, пренесен по веригата.

Хидроксилирането бива неспецифично и специфично.
В хидроксилазните системи на черния дроб се извършва неспецифично хидроксилиране на всякакви чужди за клетката вещества с цел обезвреждането им. Някои от тях, първоначално безвредни, след хидроксилирането се превръщат в мощни канцерогени.
В хидроксилазните системи на стероидогенни тъкани (адренален кортекс, тестиси, яйчници, плацента) се извършва специфично хидроксилиране като етап от синтезата на стероидни хормони (мъжки и женски полови хормони, а също минерал- и глюкокортикоиди). В бъбреци и чер дроб се извършва хидроксилиране, необходимо за превръщане на вит. D2 в активния хормон калцитриол. При синтеза на жлъчни киселини в черния дроб също се извършва специфично хидроксилиране.

5.5.4 Образуване и обезвреждане на супероксид, водороден пероксид и свободен хидроксилен радикал

Молекулният кислород има електронен недостиг във външния електронен слой. Редукцията му до вода изисква 4 електрона и 4 протона.

О2 +  2Н2  ---> 2 Н2О

Реакцията на кислород постепенно, с единичен електрон води до последователно образуване на супероксиден анион, Н2О2 и хидроксилен свободен радикал (фиг. 5-28). Това става спонтанно в присъствие на феро- и ферийони или други метални йони или редокс-системи, или под действие на ензими.
Фиг. 5-28. Образуване и обезвреждане на супероксид, водороден пероксид и свободен хидроксилен радикал.

Супероксидът е реактивно вещество, което може да модифицира клетъчни белтъци, нуклеинови киселини и липиди в мембраните и затова е токсичен.
За обезвреждане на супероксида има специален ензим супероксид дисмутаза. Тя превръща два супероксидни аниона заедно с 2 протона в кислород и Н2О2.
Дисмутация е реакция, в която 2 идентични молекули се превръщат в различни вещества. Едната молекула се окислява, а другата се редуцира. Супероксид дисмутазата има важна роля в защитата срещу токсичността на кислорода. Среща се във всички аероби и отсъства в облигатни анаероби. Човешките клетки съдържат 2 типа дисмутаза. Цитозолният ензим се състои от 2 идентични субединици, всяка от които съдържа 1 атом мед и 1 атом цинк. Митохондрийният ензим съдържа 2 манганови атома за мономерен протеин, както и бактериалната дисмутаза.
Интравенозно инжектиране на супероксид дисмутаза е в клинични изпитания при коронарно запушване, за да се намали токсичността на получаващия се супероксид при подобни увреждания.

Н2О2 е реактивно вещество, което може да модифицира клетъчни белтъци, нуклеинови киселини и липиди в мембраните и затова е токсичен. Обезврежда се, като се превръща в кислород и вода под действие на каталаза или глутатион пероксидаза и глутатион редуктаза.
Разтворите на водороден пероксид се използват като дезинфектант и за третиране на раневи инфекции.
Интересно е, че водороден пероксид специално се образува в левкоцити и макрофаги, които убиват бактерии.

Трети токсичен радикал е хидроксилният свободен радикал. Той е по-токсичен и по-реактивоспособен от другите два. Може да бъде разрушен при реакция с витамин С, бета-каротен и витамин Е. Това е в основата на защитното антиоксидантно действие на тези витамини. Може да бъде разрушен и при реакция с глутатион под действие на глутатион пероксидаза. Редуциран глутатион се осигурява под действие на глутатион редуктаза с коензим НАДФН + Н+.

5.6.-5.6.1. Цитратен цикъл: резюме

Цитратният цикъл е серия от реакции, в които осем ензима последователно разграждат ацетиловата група на ацетил-КоА до CO2 и H2O. Това е съпроводено с отделяне на водород под форма на 3 мола редуциран НАД и 1 мол редуциран ФАД. При окислението на НАДН и ФАДН2 в дихателните вериги се освобождава и акумулира енергия под форма на АТФ. Освен това 1 мол АТФ се получава на субстратно ниво.

Цитратният цикъл има централна роля в метаболизма. Той е главен катаболитен път за разграждане на въглехидрати, масти и белтъци и главен източник на АТФ - четири негови метаболита доставят водород за дихателните вериги. Той е тясно свързан и с анаболитните процеси. От негови метаболити започват важни синтезни пътища.

Цитрат синтазата катализира кондензацията на ацетил-КоА и оксалацетат, която е екзергонична и необратима реакция.

Аконитазата катализира изомеризирането на цитрат до изоцитрат.

Изоцитрат дехидрогеназата катализира необратимото окислителното декарбоксилиране на изоцитрат до a-кетоглутарат, съпроводено с отделяне на СО2 и получаване на НАДН.

a-Кетоглутарат дехидрогеназният комплекс катализира необратимото окислително декарбоксилиране на a-кетоглутарат до сукцинил-КоА. Това е единствената реакция в цикъла, където се получава макроергично съединение на субстратно ниво. Тук се отделя втората молекула СО2 и се получава НАДН.

Сукцинат тиокиназата (наричана и сукцинил-КоА синтетаза) спряга превръщането на сукцинил-КоА в сукцинат със синтеза на 1 мол АТФ от АДФ и Ф.

Сукцинат дехидрогеназата, част от комплекс ІІ в дихателната верига, дехидрогенира сукцинат до фумарат. Получава се ФАДH2. Фумарат се хидратира под действие на фумараза до малат.

Малат дехидрогеназата катализира обратимата оксидо-редукция на малат до оксалацетат, който отново може да се включи в цикъла.

Общата равносметка е, че при разграждане на 1 мол ацетил-КоА до СО2 и Н2О се получават теоретично 12 мола АТФ (или 10 съгласно корекцията на Hinkle).

Регулаторните ензими в цитратния цикъл са тези, които катализират необратимите екзергонични реакции: цитрат синтаза, изоцитрат дехидрогеназа и a-кетоглутарат дехидрогеназният комплекс. Значение за регулацията има и пируват дехидрогеназният комплекс, доставящ ацетил-КоА. Четири витамини от В-комплекс действат като кофактори на регулаторните ензими, а също и на други ензими от цикъла.

Попълващи (анаплеротични) реакции, като напр. лигазното карбоксилиране на пируват до оксалацетат, поддържат необходимата концентрация на оксалацетат и на други междинни метаболити.

При генетично обусловена недостатъчност на пируват дехидрогеназния комплекс (ПДХ) има повишени нива на лактат, пируват и аланин в серума, което води до хронична лактатна ацидоза. При такива пациенти се наблюдават тежки неврологични разстройства, в повечето случаи със смъртен изход. При шок поради намалено снабдяване на тъканите с О2 също се инхибира ПДХ и се развива лактатна ацидоза. ПДХ може да се активира с дихлорацетат, тъй като той инхибира киназата на ПДХ и не може да се получи неактивната фосфорилирана форма на ПДХ.

5.6.2 Особености и биологично значение за катаболизма и анаболизма

Като синоними се ползват и названията цикъл на Кребс (по името на откривателя му Ханс Кребс) и цикъл на трикарбоксиловите киселини.

Цитратният цикъл е серия от реакции, които водят до разграждане на ацетил-КоА до СО2 и Н2О. Това е съпроводено с отделяне на водород, при окислението на който в дихателните вериги се освобождава и акумулира енергия под форма на АТФ. Междинните продукти на цикъла действат като катализатори - те вземат участие в реакциите, но концентрацията им остава постоянна.

За цитратния цикъл са характерни следните особености:
1) Той е изключително аеробен процес. В отсъствие на кислород не функционира.
2) Локализиран е в матрикса на митохондриите, в близост с дихателните вериги.

Цитратният цикъл има централна роля в метаболизма .
1) Той е главен източник на АТФ - четири негови метаболита доставят водород за дихателните вериги;
2) Той е главен катаболитен краен път за разграждане на въглехидрати, масти и белтъци;
Междинните продукти от разграждането на тези вещества постъпват не само чрез ацетил-КоА, но и чрез a-кетоглутарат, фумарат, сукцинат, оксалацетат.
3) Цитратният цикъл е тясно свързан и с анаболитните процеси. От негови метаболити започват биосинтезите на:
- аминокиселини (a-кетоглутарат ---> глутамат, оксалацеатат ---> аспартат (има значение за трансаминиране и окислително дезаминиране);
- порфирини (сукцинил КоА и глицин)
- въглехидрати - глюконеогенеза (оксалацетат ---> фосфоенолпируват)
- мастни киселини (реакцията малат ---> пируват осигурява НАДФН); цитратът изнася ацетилови групи от митохондриите в цитоплазмата; а поредицата от реакции
цитрат ---> изоцитрат ---> a-кетоглутарат осигурява НАДФН;
- уреа (за синтезата на урея цитратният цикъл доставя СО2 и АТФ).

Споменатите процеси се извършват в различни тъкани, но черният дроб е единственият орган, където всички те се извършват в значителна степен. Затова особено тежки за организма са последствията при увреждане на голям брой чернодробни клетки (хепатит или цироза). За значението на цитратния цикъл говори и фактът, че не са описани генетични дефекти за ензимите от цитратния цикъл в живи индивиди - очевидно такива дефекти са несъвместими с нормалното развитие, с живота.

5.6.3 Химизъм на реакциите в цитратния цикъл

Обобщен вид на цитратния цикъл е представен на фиг. 5-29.
Фиг. 5-29. Метаболити и реакции в цитратния цикъл в обобщен вид. Показани са реакциите, където се получават редуцирани форми на НАД и ФАД, предаващи водород за дихателните вериги.

Подробно реакциите на цитратния цикъл са представени на фиг. 5-30.

Фиг. 5-30. Реакции на цитратен цикъл:
1 - Кондензация на оксалацетат и ацетил-КоА до цитрат; 2 - Превръщане на цитрат в изоцитрат; 3 - Окислително декарбоксилиране на изоцитрат (като b-хидроксикиселина) до a-кетоглутарат; 4 - Окислително декарбоксилиране на a-кетоглутарат (като a-кетокиселина) до сукцинил-КоА; 5 - Енергията, акумулирана в макроергичната връзка на сукцинил-КоА се пренася върху АДФ и се получава сукцинат и АТФ на субстратно ниво; 6 - Дехидрогениране на сукцинат до фумарат; 7 - хидратиране на фумарат до малат; 8 - дехидрогениране на малат до оксалацетат.

Цикълът започва с кондензация на ацетил-КоА с оксалацетат под действие на цитрат синтаза при участие на молекула вода и отделяне на Ко. Образува се С-С връзка между С от метиловата група на ацетилКоА и карбонилния С от оксалацетат. Получава се цитрат. Енергетично тази необратима реакция (DG1o' = - 31.5 kJ/mol) се осигурява от хидролиза на тиоестерната връзка в ацетил-КоА.

Цитратът се превръща в изоцитрат под действие на аконитаза, която съдържа Fe2+ под форма на Fe-S кластер. Това става двустъпално - дехидратация до цис-аконитат и рехидратация до изоцитрат. Реакциите са обратими. Цитратът е симетрична молекула, но аконитазата винаги действа върху тази част, която е от оксалацетат. Свързаният цитрат в поне три точки от активния център вече прави молекулата асиметрична. Инхибитор на аконитазата е флуорацетат. При този ензимен блок се натрупва цитрат.

Изоцитратът се дехидрогенира и декарбоксилира до a-кетоглутарат под действие на изоцитрат дехидрогеназа. Това е окислително декарбоксилиране на b-хидрокси киселина. НО-група на изоцитрат е в b-позиция спрямо -СООН група, която се декарбоксилира. СО2се отделя от оксалацетатната част. Реакцията е необратима (DG1o' = - 21 kJ/mol). Известни са три изоензима - митохондрийна НАД-зависима изоцитрат дехидрогеназа, която действа в цитратния цикъл и още два НАДФ-зависими изоензими, един в митохондриите и един в цитоплазмата. НАДН отдава Н в дихателна верига, в която се синтезират 3 мола АТФ.

Следва окислително декарбоксилиране на a-кетокиселината a-кетоглутарат до сукцинил КоА, чийто молекулен механизъм вече е разгледан (т.5.3.6). Това е третата необратима реакция в цикъла (DG1o' е - 33 kJ/mol). Тук се отделя втората молекула СО2. Катализира се от a-кетоглутаратдехидрогеназен комплекс, аналогичен на пируватдехидрогеназния комплекс. Единствено първият ензим е различен - специфичен е за a-кетоглутарат, а не за пируват. Инхибитор на това окислително декарбоксилиране е арсенит, при което се натрупва a-кетоглутарат. Продуктът сукцинил-КоА съдържа тиоестерна макроергична връзка, получена на субстратно ниво. Това е единственият пример в цитратния цикъл за енергетично спрягане на субстратно ниво. Освен това полученият НАДН предава Н в дихателна верига, където се получават 3 мола АТФ.

Енергията, акумулирана в сукцинил-КоА се пренася върху АДФ - получава се АТФ под действие на ензима сукцинат тиокиназа, наричана още сукцинил-КоА синтетаза - от обратната реакция.

В митохондрийния матрикс има втора сукцинил-КоА синтетаза, специфична за гуаниловите нуклеотиди, но тя не участва в цитратния цикъл. Алтернативна реакция в извънчернодробни тъкани се катализира от сукцинил-КоА-ацетоацетат-КоАтрансфераза (тиофораза), в която превръщането на сукцинил-КоА до сукцинат е спрегнато с активирането на ацетоацетат в ацетацетилКоА (глава 7).

Следва обратимо дехидрогениране на сукцината до фумарат под действие на сукцинат дехидрогеназа (разглеждана в ензимологията при конкурентно инхибиране с малонат - т. 4.3.4.) и като един от флавопротеините в дихателната верига (т.5.4.3). Водородът от получения ензимно свързан ФАДН2 се пренася до О2, при което се получават 2 мола АТФ. Малонатът действа като конкурентен инхибитор - натрупва се сукцинат.
Фумаразата (фумарат хидратаза) катализира обратимо присъединяване на вода към фумарат. Получава се малат.
Малатът се дехидрогенира до оксалацетат. Редуцираният НАДН предава Н в дихателна верига - получават се 3 мола АТФ.

5.6.4. Метаболитна и енергийна равносметка

Както личи от фиг. 5-29 и фиг. 5-30, на три места в цитратния цикъл има дехидрогеназни реакции с кофактор НАД, който се превръща в НАДН + Н+. В тези дихателни вериги, започващи с НАДН, се получават теоретично 3 х 3 = 9 мола АТФ (или 3 х 2.5 = 7.5 съгласно корекциите на Hinkle). В дихателната верига, започваща със субстрат сукцинат, се получават теоретично още 2 мола АТФ (или 1.5 съгласно корекцията на Hinkle). На субстратно ниво при окислителното декарбоксилиране на a-кетоглутарат до сукцинат се получава още 1 мол АТФ.
Общата равносметка е, че при разграждане на 1 мол ацетил-КоА до СО2 и Н2О се получават теоретично 12 мола АТФ (или 10 съгласно корекцията на Hinkle).
Общото намаление в свободната енергия е около 881 kJ при моларни концентрации на реагиращите вещества. При енергетично съдържание на една ~ връзка от около 34.5 kJ, синтезираните 12 мола АТФ ще съдържат около 47 % от отделената енергия, което е много висок коефициент на полезно действие. Огромната част от промяната в свободната енергия е за сметка на дихателните вериги - 800 kJ. Остатъкът от около 80 kJ идва от останалите стъпала.

Изоцитрат дехидрогеназата и малат дехидрогеназата са обикновени матриксни субстратни дехидрогенази за разлика от тройния ензимен a-кетоглутарат дехидрогеназен комплекс, където дехидрогенирането се предхожда от декарбоксилиране. Този дехидрогеназен комплекс, както и сукцинат дехидрогеназата са локализирани във вътрешната митохондриална мембрана. Сукцинат дехидрогеназата е част от комплекс ІІ в дихателната верига.

Сумарната реакция за разграждането на ацетил-КоА в цитратния цикъл и свързаните с него дихателни вериги има следния вид:
СН3СО ~ SKoA + 2О2 + 2Н2О = 2СО2 + 4Н2О + КоАSН
Цикълът започва с кондензация на ацетил коА и оксалацетат и завършва с регенерация на оксалацетат, като в хода на реакциите оцетната киселина се разгражда до вода и СО2. Фактически се разгражда част от оксалацетатната молекула, която се възстановява от внесения ацетат. В четирите окислителни стъпала се отделят 8 атома Н, а в двата етапа на декарбоксилиране се отделят два мола СО2. Молекулата на ацетата съдържа 4 атома Н, а в цикъла се отделят 8. Допълнителните 4 атома идват от двете молекули вода, които се включват в цикъла. Така при един оборот на цикъла всъщност се разгражда 1 молекула ацетат и 2 молекули вода. В четирите дихателни вериги се образуват 4 молекули вода, които ангажират 2 молекули кислород.

5.6.5 Роля на витамините

Витамините имат ключова роля за цитратния цикъл.
Четири витамина от В комплекс имат точно определени роли в цитратния цикъл:
1) В1 - под форма на ТФФ е коензим на първия ензим от a-кетоглутарат дехидрогеназния комплекс;
2) В2 - под форма на ФАД е коензим на третия ензим от a-кетоглутарат дехидрогеназния комплекс и на сукцинат дехидрогеназата;
3) пантотенова киселина е част от КоА, който като свободен кофактор поема получените при окислително декарбоксилиране ацетилов и сукцинилов радикали;
4) витамин РР - под форма на НАД е коензим на изоцитрат дехидрогеназа, малат дехидрогеназа и a-кетоглутарат дехидрогеназен комплекс, а също и на пируват дехидрогеназния комплекс, който доставя ацетил-КоА за цикъла.

5.6.6 Регулация на цитратния цикъл

Интензитетът на цитратния цикъл е под строг контрол. За разлика от други метаболитни вериги, в които има един скорост-определящ ензим, в цикъла има три регулаторни ензими. Това са цитрат синтаза, изоцитрат дехидрогеназа и a-кетоглутарат дехидрогеназен комплекс. Тези реакции катализират трите силно екзергонични и необратими стъпала в цитратния цикъл. Освен това, значение за регулацията на цитратния цикъл има и пируват дехидрогеназен комплекс (ПДХ), доставящ ацетил-КоА.

Наличието на субстрати, необходимостта от междинните метаболити като биосинтетични прекурсори и изискванията за АТФ са фактори, повлияващи интензитета на цикъла (фиг. 5-31).

Фиг. 5-31. Регулация на пируват дехидрогеназния комплекс (ПДХ) и цитратния цикъл. Зеленият цвят означава активиране, а червеният - инхибиране.

ПДХ се инхибира алостерично от високи стойности на отношенията [АТФ] / [АДФ], [НАДН] / [НАД+] и [ацетилКоА] / [КоА], които са показатели за наличие на енергия и субстрати. При намаляване на тези отношения АМФ, КоА и НАД+ активират алостерично ПДХ.

Интензитетът на цикъла се намалява при недостиг на субстратите (оксалацетат и ацетил-КоА) или НАД+. Сукцинил-КоА, АТФ и цитрат са алостерични инхибитори на началните реакции. Са2+ сигнализират мускулното съкращение и стимулират окислителните реакции, при които се отделя и акумулира енергия.

Влияние на отношенията на нуклеотидите: АТФ/АДФ и НАДН/НАД+.
Вече знаем какво представлява дихателният контрол (т. 5.4.7). Посредством отношението АТФ/АДФ се регулира интензитета на окисление и окислително фосфорилиране в дихателните вериги. Те от своя страна регулират интензитета и на цитратния цикъл. Активността на цикъла зависи от доставянето на окислени дехидрогеназни кофактори (НАД и ФАД), което пък зависи от наличието на АДФ, т.е от скоростта на използване на АТФ. Следователно, при наличие на кислород, скоростта на използване на АТФ за работа определя скоростта на окисление и активността на цикъла.

Алостерично повлияване
Ефекторите могат да бъдат нуклеотиди, метаболити от самия цикъл или други вещества.
Всички регулаторни дехидрогенази се активират от Са2+, чиято концентрация нараства при мускулно съкращение и секреция - т.е. при процеси, изискващи енергия.
Цитрат синтазата се инхибира алостерично от АТФ и НАДН. Изоцитрат дехидрогеназата се стимулира алостерично от АДФ, а НАДН и АТФ действат като алостерични инхибитори.
Пируват дехидрогеназният и a-кетоглутарат дехидрогеназният комплекс се инхибират алостерично от НАДН и ацетилКоА/сукцинил КоА.

Особено важни за регулацията са субстратите оксалацетат и ацетилКоА.
Цитратният цикъл спира, ако няма оксалацетат. Той е ограничаващ метаболит. Интензитетът на цикъла зависи от концентрацията на оксалацетат. Последствията от спиране на цикъла са неблагоприятни - снижава се производството на АТФ и се натрупва в излишък ацетилКоА, от който се получават кетонови тела (глава 7). При голям излишък от кетонови тела се стига до опасно животозастрашаващо състояние - кетоацидоза. За да не се получи всичко това, съществуват т.н. попълващи (анаплеротични) реакции (т. 5.6.7).
Ако оксалацетатът е в излишък, той като конкурентен инхибитор инхибира сукцинатдехидрогеназата.

АцетилКоА е мощен алостеричен активатор на пируват карбоксилазата (глава 6).
Цитратът, когато е в излишък, действа като алостеричен инхибитор на фосфофруктокиназата - блокира гликолизата (глава 6), а с това и своето получаване. Освен това, той минава в цитоплазмата и там действа като мощен алостеричен активатор на ацетилКоА карбоксилазата - т.е. стимулира липогенеза (глава 7).

Тази система на контрол и балансиране обезпечава при нормално постъпване и използване на междинните метаболити регулация на биохимичните реакции - за да няма нито излишък, нито недостиг на метаболити. Нарушения на този баланс се получават при гладуване и диабет.

5.6.7 Попълващи (анаплеротични) реакции

Пируватът, освен като източник на ацетил-КоА (реакция 1 на фиг. 5-32), при необходимост може да се превръща и в оксалацетат (реакция 2 на фиг. 5-32). Това е много важна попълваща (анаплеротична) реакция за цитратния цикъл. Тя представлява лигазно карбоксилиране на пируват до оксалацетат.


Фиг. 5-32. Попълващи (анаплеротични) реакции за цитратния цикъл.

Чрез тази реакция се поддържа нивото на оксалацетат, началния задвижващ и краен метаболит на цитратния цикъл. Тази реакция е втора връзка между гликолиза и цитратен цикъл, освен окислителното декарбоксилиране на пируват. Освен това, тя е част от глюконеогенеза (вж т. 6.2.2).
Чрез тази реакция въглехидратите авторегулират своята обмяна, а с това и обмяната на мастите.
Друга реакция с подобна роля е редуктивното карбоксилиране на пируват до малат под действие на малат ензим с кофактор НАДФН (реакция 3 на фиг. 5-32). Тази реакция е обратима, затова малат ензимът има и друго название: НАДФ-зависима декарбоксилираща малат дехидрогеназа.
Попълващи са също реакциите, при които аминокиселини се превръщат в метаболити на цитратния цикъл (глава 8).

5.7. Приложение на познанията в клиничната практика. Пируват дехидрогеназна недостатъчност

При деца са описани различни смущения в пируватния метаболизъм, дължащи се на недостатъчност на една или друга каталитична или регулаторна субединица на пируват дехидрогеназния комплекс (ПДХ). Обикновено това води до повишени нива на лактат, пируват и аланин в серума, което води до хронична лактатна ацидоза. При такива пациенти се наблюдават тежки неврологични разстройства и в повечето случаи се стига до смърт.

Диагнозата на пируват дехидрогеназната недостатъчност се поставя обикновено чрез определяне активността на ензимния комплекс и/или активността на отделни субединици в култури от кожни фибробласти, взети от пациент.
В някои случаи пациентите се повлияват добре от кетогенна диета, а въглехидрати се поемат в минимално количество.

Пируват дехидрогеназният комплекс е активен във дефосфорилираната си форма и неактивен във фосфорилираната форма. При шок поради намалено снабдяване на тъканите с кислород се инхибира пируват дехидрогеназния комплекс и се развива лактатна ацидоза. Затова в този случай се дава дихлорацетат, който инхибира киназата на ПДХ комплекс и следователно активира ПДХ комплекс [7] - виж фиг. 5-33.

Фиг. 5-33. Активиране на пируват дехидрогеназния комплекс чрез дихлороацетат, който инхибира киназата на ПДХ комплекс и не позволява да се получи неактивната фосфорилирана форма на комплекса.

5.8. Материали за самостоятелна работа

1. Проиграйте теста  "Биоенергетика" в желан от Вас режим.

2. Свалете от сървъра, разархивирайте и проиграйте анимацията на дихателната верига mito.zip , създадена от Jim D. Morton, New Zealand с различни субстрати, инхибитори на електронния транспорт, разпрягащи агенти и инхибитори на окислителното фосфорилиране. За целта отворете файла "mito.exe"

3. Свалете от сървъра, разархивирайте и проиграйте анимацията rcr.zip,
създадена от Jim D. Morton, New Zealand. Изпробвайте различни субстрати и ефектори при симулиране на полярографски запис за измерване на кислородната консумация и дихателен контрол в изолирани митохондрии. За целта отворете файла "TRCR.exe"

4. Посетете: http://www-medlib.med.utah.edu/NetBiochem/graphlis.htm#Bioenergetics

Oт там изберете следните анимации, които отразяват спрягането между електронния транспорт, протонната транслокация и синтезата на АТФ.
low_atp ( http://www-medlib.med.utah.edu/NetBiochem/movies/low_atp.mov) и

high_atp (http://www-medlib.med.utah.edu/NetBiochem/movies/high_atp.mov)

5.9 Литература

1. Николов, Т. Обща биохимия за биолози и биохимици, 1991, Наука и изкуство, София.
2. Montgomery, R., T. Conway, A. Spector. (1996) Biochemistry. A Case-Oriented Approach. The C. V. Mosby Company, St. Louis, Sixth Edition.
3. Murray, R., D. Granner, P. Mayes, V. Rodwell (1996) Harper's Biochemistry, Prentice-Hall International, Inc., Twenty-Fourth Edition.
4. Lehninger, D., D. Nelson, M. Cox, Principles of Biochemistry (1993) Worth Publishers, Second Edition.
5. Страйер, Л. Биохимия. Пер. с англ. Мир, 1985, т. 2, стр. 60
6. Hinkle, P. C., Kumar, M. A., Resetar, A. and Harris, D. L. Biochemistry, 30, 1991, 3576-3582. Mechanistic stoichiometry of mitochondrial oxidative phosphorylation.
7. Cross, R. L. Ann. Rev. Biochem. 50, 1987, 687.
8. Misra, P. S., Lefevre, A., Ishii, H.., Rubin, E. and Lieber, C. S. Am. J. Med. 51, 1971, 346. Increase of ethanol, meprobamate and pentobarbital metabolism after chronic ethanol administration in man and rats.
9. Patel, M.S. and Haris, R. A. FASEB J. 9, 1995, 1164. Mammalian a-keto acid dehydrogenase complexes: gene regulation and genetic diseases.

Обмяна на въглехидрати

Цели

Цели на преподавателя:
Да се разгледат метаболитните пътища във въглехидратната обмяна и да се дадат примери за заболявания, произтичащи от дефекти в тази обмяна.

След работа с този раздел студентите ще могат да постигнат следните учебни цели:

А. Знания
1. Да дадат определение и примери за значението на всеки от пътищата във въглехидратната обмяна: гликолиза, глюконеогенеза, пентозо-фосфатен път, синтеза и разграждане на гликоген, обмяна на галактоза и обмяна на фруктоза;
2. За всеки от споменатите пътища да пишат с формули химичните реакции и да посочат ензимите, които ги катализират
3. Да изброят видовете совалки за пренос на водород и да опишат съставните им компоненти;
4. Да посочат кои са необратимите стъпала в гликолитичната верига и в глюконеогенезата;
5. Да посочат кои са регулаторните ензими за гликолиза и глюконеогенеза;
6. Да посочат общите метаболити за гликолиза и пентозофосфатен цикъл;

Б. Разбирания
1. Да обяснят защо гликолизата може да протича в анаеробни условия;
2. Да обяснят как се осигурява окислен НАД за окислителното фосфорилиране на глицералдехид-3-фосфат в гликолизата;
3. Да сравнят и обяснят приликите и разликите между окислителното фосфорилиране на глицералдехид-3-фосфат и енолазната реакция в гликолизата;
4. Да обяснят ролята на окислителното декарбоксилиране на a-кетокиселини за въглехидратната обмяна;
5. Да обяснят действието и значението на малатната и глицерол-фосфатната совалкови системи;
6. Да илюстрират с конкретни примери как се получава НАДФН, необходим за обезвреждане на свободни радикали;
7. Да обяснят разликите между хидролитно и фосфоролитично разграждане на гликоген;
8. Да обяснят причините, поради които може да възникне лактатна ацидоза;
9. Да разбират и обяснят последствията от недостатъчност на пируваткиназа, фруктозо-1,6-бисфосфатаза, глюкозо-6-фосфатаза, глюкозо-6-фосфат дехидрогеназа, мускулна гликоген фосфорилаза, галактозо-1-фосфат уридилтрансфераза, галактокиназа;

В. Умения
1. Да разграничат в кои стъпала на гликолиза и цитратен цикъл се получават макроергични съединения, предшественици на АТФ и в кои стъпала се получава АТФ;
2. Да приложат познанията си върху макроергични съединения и да определят кои междинни метаболити, продукти или субстрати в гликолизата и цитратния цикъл са макроергични съединения;
3. Да посочат връзките между гликолиза и дихателните вериги;
4. Да посочат връзките между гликолиза и цитратен цикъл;
5. Да изчислят енергетичния добив при анаеробно разграждане на една молекула глюкоза до пируват и при аеробно разграждане до СО2 и H2O;
6. Да изчислят енергетичните разходи за синтеза на една молекула глюкоза от лактат;
7. Да сравнят протичането на гликолиза в различни тъкани и да посочат особеностите за всяка тъкан (черен дроб, мозък, скелетни мускули, сърдечен мускул, еритроцити, мастна тъкан);
8. Да приложат познанията си върху алостерично повлияване, за да обяснят регулацията на гликолиза и глюконеогенеза;
9. Да илюстрират с примери защо глюкозо-6-фосфат е възлов метаболит.
10. Да приложат познанията си върху фосфорилиране-дефосфорилиране, за да обяснят реципрочно координираната регулацията на гликогенолиза и гликогеногенез